Способ определения деструкции эндоплазматического ретикулума клеток печени

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕСТРУКЦИИ ЭНДОШ1АЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА КЛЕТОК ПЕЧЕНИ путем исследования активности ферментов, о т ли ч а rani и и с я тем, что, с цедаю новышения специфичности способа, в гомогенате клеток печени определяют скорость инактивации цИтохррма Р-450 и при увеличении её уровня по сравнению с нормой определяют деструкцию эндоштазматического ретикулума.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ(К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3411450/28-13 (22) 18.03.82 (46) 28.02.85. Бюл. В 8 (72) А.И.Арчаков, Г.И;Бачманова, Е.А.Бородин, О.К.Погодина, О.В.Добрынина, В.Л.Мигушина и И.Г.Савин (71) 2-й Московский ордена Ленина государственный медицинский институт им. Н.И.Пирогова (53) 616.07(088.8) (56) 1. Боровков С.А. и др. Методы исследования при хирургических заболеваниях печени. N., "Медицина", 1973, с. 163, 1972 (прототип).

„„ЯО „„1142802

4Ist> G 01 N 33/48; А 61 В. 10/00 (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕСТРУКЦИИ ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА

КЛЕТОК ПЕЧЕНИ путем исследования активности ферментов, о т л и ч а юшийся тем, что, с цепью повышения специфичности способа, в гомогенате клеток печени определяют скорость инактивации цитохррма Р-450 и при увеличении ее уровня по сравнению с нормой определяют деструкцию эндоплазматического ретикулума.

1 11428

Изобретение относится к биохимии и экспериментальной медицине и может найти грименение как скрининг-тест для выявления повреждений мембраны эндоплазматического ретикулума пеS чени при моделировании заболеваний печени и оценке эффективности действия гепатотропных лекарственных средств.

Известен способ оценки состояния плазматических мембран печени по выходу в кровь ферментов цитозоля клеток печени (альдолазы, аминотрансферазы, лактатдегидрогеназы и др.), наступающего при разрушении плазматических мембран (1) .

Однако указанный способ не харак-. теризует состояние внутриклеточных мембран, в частности мембран эндоплазматического ретикулума, в которых локализованы фермептные системы, ответственные за. детоксицирующую функцию печени. И наконец, ферменты, появляющиеся в крови при разрушении плазматических мембран печени, не обладают абсолютной специфичностью для печеночной ткани. Активность этих ферментов в крови может возрастать и при повреждении других органов и тканейу например при поражении ЗО миокарда, поперечно-полосатой мускулатуры, почек и др.

Цель изобретения — создание скри- нинг-теста, специфичного для повреждения мембран эндоплазматического ретикулума печени, позволяющего выявлять повреждения мембран на ран.— них стадиях заболевания.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения деструкции эндоплазматического рети

40 кулума клеток печени путем исследования активности ферментов, в гомогенате клеток печени определяют скорость инактивации цитохрома P-450 и при увеличении ее уровня по сравнению с нормой определяют деструкцию эндоплазматического ретикулума.

Способ осуществляют следующим образом.

Кусочки ткани печени в 0,5-1,0 г гомогенизируют в 6 мл 100 мМ т1)ис;HQ буфера, рН 7,6 полученный гомогенат помещают в кюветы спектрофотометра, через опытную кювету в течение 1 мин пропускают окись углерода, в обе кюв":òbt добавляют по несколько кристалл ликов дитпонита натрия и при 37 С в тr е.;".. 30 мин с интервалами по

02 2

5 мин записывают спектры поглощения комплекса восстановленной формы цитохрома P-450 с окисью углерода в интервале длины волн 400-500 нм.

Скорость инактивации регистрируют спектральными методами и оценивают изменение разницы поглощения при 420 и 450 нм (hA42 4 нм). Полученные ре. зультаты сравйивают со скоростью инактивации в неповрежденной печени и при скорости инактивации выше, чем в контроле, устанавливают повреждение мембран эндоплазматическог0 ретикулума.

Пример i . Повреждения мембран печени крыс вызывали введением животным внутрибрюшинно фенобарбитала (8 мг/-100 г веса) в течение 3 дн.

Контрольным животным внутрибрюшинно вводили физиологический раствор. Каж. дая из групп состояла из десяти животных. Через 24 ч после прекращения введения фенобарбитала животных забивали декапитацией. В гомогенатах из печени на спектрофотометре "Хитачи-356" регистрировали скорость инактивации цитохрома Р-450 по А4)о 45рнм

Через 30 мин после восстановления цитохрома P-450 дитионитом натрия в гомогенатах печени контрольных крыс в спектре поглощения отмечается максимум при 420 нм, характеризующий переход цитохрома P-450 в неактивную форму — цитохром Р-420. При сравнении скорости инактивации цитохрома

P-450 в гомогенатах из печени контрольных и получавших фенобарбитал животных выявляют деструкцию мембран эндоплазматического ретикулума фенобарбиталом, о чем свидетельствует резко выраженное возрастание скорости инактивации цитохрома P-450.

Пример 2. Повреждения мембран печени крыс вызывали введением жи вотным внутрибрюшинно гелиотрина (30 Mr/100 r веса) однократно.

Контрольным крысам внутрибрюшинно вводили физиологический раствор. Через 24 ч животных забивали декапитацией. Скорость инактивации цитохрома

P-450 в гомогенатах печени регистрировали аналогично примеру 1. Повреждение мембран эндоплазматического ретикулума гелиотрином сопровождается резким возрасты.ием скорости инактивации цитохрома P-450.

Таким образом, регистрация скорости инактивации цитохром» Р-4)0

3 1142802 4 в гомогенатах печени может быть ис- перименте — при моделировании заболепользована как скрининг-тест для вы- ваний печени и исследований зффективявления повреждений мембран эндоплаз- ности действия гейатотропных лекарст

1 матического ретикулума печени в экс- венных средств.

Составйтель И.Емельяненко

Редактор N.Êåëåìåø Техред Т.Фанта Корректор О. Билак

Заказ 731/40 Тираж 897 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4