Способ получения сорбента для очистки ферментов и белков

 

Изобретение относится к способу получения сорбента для очистки ферментов и белков и позволяет получить сорбент с повьтенной емкостью. Макропористый кремнезем по.следовательнообрабатывают .Tf -глицидооксипропиЛ- триэтоксисиланом и фенилглицидиловым эфиром при соотношении 7-11. мМ эфира на 10 г модифицированного носителя. Вторую стадию проводят в диоксане в присутствии эфирата трёхфтористого бора . 1.3.П.Ф-ЛЫ, 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЩЮЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3913089/30-26 (22) 16.04.85 (46) 30.01.87. Бюл. Р 4 (.71) Научно-производственное объединение "Фермент" и Научно-производственное объединение "Биолар" (72) В.А.Кадушевичюс, И.-Г.И.Песлякас, Я.Я.Гибиетис и P.À.Ìåëíãaëâà (53) 543.544(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N9 935121, кл. В 01 D 15/03,1980.

Chang S. Н., Gooding К.М,, Reg.nier F.E. Use of oxiranes in the preparation of Ьопйей phase supports. ,Journal Chromatography, 1976, ч. 120, р. 321-323.

„„SU„„3286268 А1 D 4 В 01 J 20/10, В 01 D 15/08 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ

ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТОВ И БЕЛКОВ (57) Изобретение относится к способу получения сорбента для очистки ферментов и белков и позволяет получить сорбент с повышенной емкостью. Макропористый кремнезем последовательно обрабатывают 7 -глицидооксипропилтриэтоксисиланом и фенилглицидиловым эфиром при соотношении 7-11.мМ эфира на 10 г модифицированного носителя.

Вторило стадию проводят в диоксане в присутствии эфирата трехфтористого бора. I.з.п.ф-лы, 2 табл.

12862

Изобретение относится к способу получения сорбента для очистки ферментов и белков и может быть использовано в производстве высокоочищенных белковых препаратов и ферментов.

Цель изобретения — повышение сорбционной емкости сорбента.

Пример 1. 150 г силохрома

С-80 обрабатывают при перемешивании

800 мл 27-ной азотной кислоты в течение 2 ч при 90 С. После этого гидроксилированный носитель отфильтровывают, промывают водой до нейтральной реакции промывных вод и отжимают на фильтре. Влажный полупродукт используют для дальнейшей обработки без высушивания. Его обрабатывают 675 мл

lOX-ого водного раствора эпоксипро— пилтриэтоксисилана при рН 3,5-4,5 в течение 2 ч при 85 С, периодически перемешивая. Продукт отфильтровывают, промывают .водой, ацетоном и высушивают Содержание эпоксигрупп для сило— хрома С-80 составляет 140-150 мкмоль/г.

В шестилитровую трехгорлую колбу, снабженную механической мешалкой, обратным холодильником и капель-ной воронкой, заливают 966 мл эпихлоргидрина и поднимают температуру до 60 С.

В капельную воронку заливают раствор фенола, который получают при ряство— рении 1 кг фенола в растворе NaOH (513 г ИаОН растворяют в 1835 мл дистиллированной воды). Раствор Фенола вводят в эпихлоргидрин при постоянном перемешивании смеси в течение

4,5-5 ч. После реакции смесь фильтруют, а фильтрат промывают в делительной воронке 6-8 порциями воды 40 (no 1 — 1«5 л). Верхний слой собирают, высушивают над безводным MgSO . Продукт очищают вакуумдистипляцией при

92 С (6 мм рт.ст.). Получают 460

480 мл фенилглицидилового эфира (вы- 45 ход 50%).

20 г глицидилсилильного силохромя .С-80, полученного на первой стадии, заливают 80 мл абсолютного диоксана, содержащего 2 мл (7,4 мМ лиганда на

10 r носителя) фенилглицидилового эфира, полученного на второй стадии, добавляют 1,6 мл свежеперегнанного эфирата трехфтористого бора, смесь перемешивают 5 мин при комнатной температуре, затем 2 ч при 90"С. Продукт отфильтровывают, промывают диоксаном, водой, ацетоном и высушивают

68 2 при 110-1150С, Концентрация лиганда в сорбенте 79,5 мкмоль/г.

Пример 2. 20,0 г глицидилсилильного силохрома С-80, полученного по примеру 1, заливают, 80 мл . абсолютного диоксана, содержащего

3 мл фенилглицидилового эфира (11 мМ лиганда íà 10 r носителя) и реакцию проводят по примеру 1. Концентрация лиганда в сорбенте 103 мкмоль/г.

Пример 3. На 100 г глицидилсилильного силохрома С-120, полученного по примеру 1 (при использовании в качестве носителя силохрома С-120), заливают 350 мл абсолютного диоксана, добавляют 20 мл фенилглицидилового эфира (11 мМ лиганда на IO г носителя), добавляют 7,4 мл эфирата трехфтористого бора и реакцию проводят по примеру 1. Концентрация лиганда в сорбенте !22,3 мкмоль/г.

II р и м е р 4. 70 г глицидилсилильного силохрома С-80, полученного по примеру 1, заливают 245 мл абсолютного диоксана, содержащего 10,5 мл фенилглицидилового эфира (!l мМ лиганда на 10 г носителя), полученного по примеру 1, добавляют 4,9 .мл (0,7 мл на 1О г носителя) свежеперегнанного эфирата трехфтористого бора и реакцию проводят по примеру 1. Концентрация лиганда в сорбенте 84,8 мкмоль/г. .II р и м е р 5. 20,5 г глицидилсилильного силохрома С-80, полученного по примеру 1, заливают 102,5 мл 5 мМ раствором HCI и эпоксигруппы носите— ля гидролизуют до диольных перемешиванием суспензии 2 ч при комнатной температуре. Носитель отфильтровывают, промывают водой, этанолом и высушивают. 20 г полученного диольного си— лохрома С-80 заливают 80 мл абсолютного диоксана, содержаи его 2 мл фенилглицидилового эфира (7,4 мМ лиганда на 10 r носителя ), добавляют

l,6 мл эфирата трехфтористого бора, смесь перемешивают 5 мин при комнатной температуре и 2 ч при 90 С. Сорбент промывают диоксаном, водой, ацетоном и высушивают. Концентрация лиганда в сорбенте 69,4 мкмоль/г.

Сорбиионную емкость сорбентов определяют в условиях статической сорбции в 0,02 М натрий-фосфатном буфере рН 7.,1, содержащем 2 M NaC1. 1 r сорбента, полученного по примерам 1-5, уравновешивают исходным буфером, декантируют и заливают 3 мл раствора

1286268

Десорбцию осуществляют линейным градиентом 3,0-0 М хлорида натрия.

Скорость элюирования !5 мп/ч.

Формула и з о б р е т е н и я

1. Способ получения сорбента для очистки ферментов и белков, включающий активирование макропористого кремнеземного носителя 3 -глицидооксипропилтриэтоксисиланом с последующей обработкой гидрофобным ароматическим лигандом в присутствии эфирата трехфтористого бора в среде диоксана и промывкой продукта, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения сорбционной емкости сорбента, в качестве лиганда используют фенилглицидиловый эфир.

Таблица 1

2. Способ по п.1 о т л и ч а юшийся тем, что обработку лигандом проводят при соотношении 7-11 мМ лиганда на 10 г активированного носителя в 35-40 мл диоксана, содержащего 0,7-0,,8 мл эфирата трехфтористого бора.

Глицидилсилильный

Используемый лиганд

Сорбенты, получен-. ные по способу носитель

Предлагаемому по примерам 1

С-80 Фенилглицидиловый 79,5 эфир

103,0

84,8

>32 (32

69,4

51 0

Пример 3

С-120 Фенилглицидиловый эфир

122,3

17,6

Бензиловый спирт 37,0

С-80 Бензиловый спирт 52-56

8,8

Октиловый спирт

Дециловый спирт

1,8 альбумина человеческой сыворотки (Реанал, BHP) с концентрацией 20 мг/мл в буфере с 2 М NaC1. Суспензию сорбента перемешивают 2 ч при комнатной температуре, после чего сорбент пере- 5 носят на стеклянный фильтр. Несорби-— рованный белок отмывают буфером с

2 M NaC1. Сорбированный белок ресорбируют 0,02 M натрий-фосфатным буфером, рН 7,1, без NaC1. Концентрацию альбумина определяют измерением оптической плотности .растворов при

280 нм по калибровочной кривой.

Сравнительные данные концентрации лиганда и сорбционной емкости сорбентов, полученных по предлагаемому и известному способам, приведены в табл.1.

Пример 6. В табл.2 приведены данные хроматографических испытаний сорбентов по предлагаемому и известному способам при выделении трипсина.

Условия испытаний: количество сорбента 1 r колонка размером 8х120 мм; буфер: 20 мМ трис-НС1, содержащий

2 мМ CaCI и 3 М NaC1 при рН 6,8.

Известному MCA-1500 Фенол

Концентра- Сорбционная ция лиган- емкость сорда,мкмоль/г бента, мг/г

1286268

Т а б л и ц а 2

Десорбировано

Сорбировано

Нанесено

Лиганд

Активность

Белок Активность

Белок

Белок, Ед. прот мг акт °

7 ед. 7 мг /. ед. 7 мг

Известный

Бензиловый

Составитель Т.Чиликина

Редактор М.Петрова Техред М.Ходанич Корректор Н.Король

Заказ 7658/8 Тираж 509 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие,г.ужгород,ул.Проектная,4 спирт,конц. лиганда

56,3 мкмоль/г 4,02

Фенилглицидиловый эфир, конц.лиганда

84,8 мкмоль/г 2,45

28,20 0,60 14,92 17,2 60,99 "0,12 20,00 2,33 13,55

73,80 0,87 35,51 48,22 65,34 0,87 100,0 20,65 42,82