Способ выделения нативных фракций из одноклеточных микроорганизмов

 

1. Способ выделения нативных фракций из одноклеточных микроорганизмов путем механической дезинтеграции , отличающийся тем, что суспензию клеток микроорганизмов с концентрацией 1-20 мас.% при рН 4,5-9,5 и температуре подвергают дезинтеграции в декомпрессионном дезинтеграторе с рабочим давлением 3-30 МПа, затем предварительно раздробленную суспензию обрабатывают в баллистическом дезинтеграторе. 2.Способ ПОП.1, отличающийся тем, что суспензию клеток микроорганизмов подвергают дезинтеграции в декомпрессионном дезинтеграторе 2-6 раз. 3.Способ по П.1, отличающийся тем, что одноклеточными микроорганизмами являются дрожжи вида Sacharomyces cerevisiae, Candida р Torulopsis, Rhodotorula, Oidium, Pichia, Hansenula. 4.Способ no П.1, отличающийся тем, что одноклеточными микроорганизмами являются бактерии вида Megaterium, Methanomonas, Escherichia coli, грибки и водоросли. е (Л

: СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

03 А1 (!9) SU (и) (594 С 12 N! 06,ц1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (89) 225684 (21) 7772257/28-13 (22) 01.02.82 (31) PV 4337-81 (32) 10.06.81 (33) CS (46) 23.02.87. Бюл. У 7 (7 1) Устреди про выналвзы а объевы

ЧСАВ (CS) и Всесоюзный научно-исследовательский институт синтеза белковых веществ (SU). (72) Владимир Шилингер, Зденек Фенцл франтишек Иахек (С$), А.Н.Григорян, А.П.Ковалев,В.В.Лалов и Т.А.Лущик (SII) (53) 663.18(088.8) (54) СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ НАТИВНЫХ ФРАКЦИЙ ИЗ ОДНОКЛЕТОЧНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ (57) 1. Способ выделения нативных фракций из одноклеточных микроорганизмов путем механической дезинтеграции, отличающийся тем, что суспензию клеток микроорганизмов с концентрацией 1-.20 мас.Ж при рН 4,5-9,5 и температуре 0-70 С подвергают дезинтеграции в декомпрессионном дезинтеграторе с рабочим давлением 3-30 MIIa затем предварительно раздробленную суспенэию обрабатывают в баллистическом дезинтеграторе.

2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что суспензию клеток микроорганизмов подвергают дезинтеграции в декомпрессионном дезинтеграторе 2-6 раз. 4

3. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что одноклеточными микроорганизмами являются дрожжи вида Sacharomyces cerevisiae, Candida

Torulopsis, Rhodotorula, 0idium,.

Pichia, Hansenula.

4. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что одноклеточными микроорганизмами являются бактерии вида Megaterium, Methanomonas, Fscherichia cali, грибки и водоросли.

1291603

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способам выделения нативных фракций из одноклеточных микроорганизмов методом механической дезинтег- 5 рации с целью изоляции отдельных фракций или их смесей, и может быть использовано при приготовлении концент-. ратов пищевого протеина

Известен способ выделения нативных фракций из одноклеточных микроорганизмов путем баллистической дезинтеграции (авт.св. ¹ 810808,С 12 М 1/00, 1978) .

При применении баллистических дезинтеграторов можно в промышленном масштабе при непрерывной технологии достичь любой необходимой степени разрушения клеток при соответ20 ствующем продолжении времени переработки материала.

Недостатками этого способа являются локальный перегрев обрабатываемого вещества, что приводит к необхо-, димости. интенсивного охлаждения, повторное разрушение уже полученных клеточных фрагментов с образованием черезвычайно мелких частиц (от единиц до сотых долей микрона), что значительно усложняет дальнейшее разделение твердой и жидкой фаз. Все это вместе взятое, т.е. увеличение расхода воды для охлаждения, электроэнергии, более длительное время обработки биомассы, удорожает процесс дезинтеграции и повышает конечную стоимость продукта.

Наиболе близким по технической щ сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому является способ выделения нативных фракций из одноклеточных микроорганизмов путем механической дезинтеграции с использованием 45 эффекта декомпрессии (авт. св. ¹602651 кл. С 12 M 1/04, 1975). Суспензия микроорганизмов насыщается газом под давлением (азотом, воздухом, углекислым газом), который не должен реагировать с внутриклеточными компонентами и также не должен ингибировать энзимы, особенно эндофенные ядра, используемые для деградации нуклеиновых кислот в микробиальном белке. При этом газом насыщаются и клетки до выравнивания парциального давления с обеих сторон клеточной оболочки, после чего суспензия резко переводится в зону атмосферного давления. Результатом является градиент давления газа в клетке, направленный во внешнюю среду, Поскольку скорость выхода газа из клетки выше скорости диффузии через клеточную оболочку происходит разрыв последней.

Дезинтеграция способом быстрой декомпрессии осуществляется в устройстве, состоящем из компрессора газа, насоса-дозатора высокого давления для суспензии микроорганизмов и двух цилиндров высокого давления для насыщения и перевода суспензии.

Преимущество декомпрессионной дезинтеграции заключается в том, что клетки или же клеточные оболочки после дезинтеграции остаются целыми или незначительно размельченными и, следовательно, их можно легко отделить от протоплазмы при помощи сепарации.

Описанный способ не приводит к инактивации внутриклеточных энзимов и позволяет выделять химические компоненты клеток B нативном состоянии.

Энергетические затраты при декомпрессионной дезинтеграции низкие и составляют 0,06 квт ч/кг, тогда как при экструзионном или баллистическом разрушении клеток расходуется

0,2-0,4 кВт/ч/кг.

Однако процесс декомпрессионной дезинтеграции не обеспечивает достаточно., высокой степени выхода внутриклеточных химических компонентов во внешнюю среду, а также на него оказывает значительное влияние рН перерабатываемой суспензии, поэтому необходимо процесс дополнить экстракцией . биомассы разрушенных клеток.

Это проиллюстрировано в таблице, где показана величина рН суспензии дрожжей Sacharomyces cerevisiae в зависимости от степени извлечения водорастворимого белка во внутриклеточную среду (супернант) из клеток, разрушенных декомпрессионным способом. Для сравнения приведены значения для одно- и шестикратной дезинтегра-. ции, Количество водорастворимого белка в неразрушенной клетке составляет

20Х от общего содержания протеина (Nx 6,25).

Как видно из таблицы, практически все количество водорастворимого белка освобождается из дезинтегриро1291603 ванных клеток только при рН 9,0.

Степень извлечения белка при рН 11, превышающую 1007, можно объяснить .дополнительным растворением щелочерастворимых фракций протеина. Разрушающее действие декомпрессии на оболочку клетки длится сотые доли секунды. После этого клетка уже не подвергается механическому напряжению и из нее вытекает только часть протоплазмы, содержащей протеин.

При повторном декомпрессионном воздействии, в межклеточное пространство переходит еще некоторая часть белка, количество которого зависит от рН внешней среды и количества дезинтеграции. Нарушений оболочки клетки, однако, уже больше не происходит.

Таким образом, существует пропорциональная зависимость между количест- 20 вом выделяющегося из клетки белка и числом операций дезинтеграции, а также значением рН суспензии.

Недостатком известного способа является низкий выход белка во время дезинтеграции суспензии при рН около

7,0, необходимы также более высокие значения рН для более полного освобождения или даже выделения белка из 30 разрушенных клеток, степень выхода внутриклеточных нуклеаз более низкая, чем при дезинтеграции баллистическими дезинтеграторами.

Целью изобретения является выделение внутриклеточных химических компонентов в нативном состоянии из биомассы микроорганизмов на более короткое время и при более низких энергетических затратах с высоким 40 выходом и получением суспензии, содержащей довольно крупные клеточные ферменты, отделение которых на стандартных сепараторах не представляет трудности. 45

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения нативных фракций из одноклеточных микроорганизмов путем механической gp дезинтеграции суспенэию клеток микроорганизмов с концентрацией 1-20 мас.Е при рН 4,5-9,5 и температуре 0,70 С сначала подвергают дезинтеграции в декомпрессионном дезинтеграторе с рабочим давлением 3-30 МПа, после чего предварительно раздробленную суспензию обрабатывают в баллистическом деэинтеграторе.

При этом суспенэию клеток микроорганизмов подвергают дезинтеграции в декомпрессионном деэинтеграторе

2-6 раз, а одноклеточными микроорганизмами являются дрожжи вида Sacharomyces cerevisiae, Candida, Torulopsis, Rhodomorula, 0idium, Pichia, Hansenula, бактерии вида Megaterium, Methanomonas, Escherichia coli грибы и водоросли.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Выделение нативных фракций из одноклеточных микроорганизмов производят из их водной суспенэии с концентрацией клеток 1-20 мас.7, при 0-70 С б и рН 4,5-9,5. Суспензию один или несколько раз обрабатывают в периодическом или непрерывном деэинтеграторе. В качестве рабочего газа применяют воздух, азот или любой другой газ, химически инертный по отношению к клеткам. Суспенэию насыщают сжатым воздухом под давлением

3-30 YJIa, выдерживают под давлением

15-60 с и переводят в область барометрического давления. При этом происходит декомпрессионная дезинтеграция клеток микроорганизмов.

Далее суспенэию обрабатывают в баллистическом дезинтеграторе, содержащем мелющие тела с диаметром 0,40,5 мм, преимущественно при соотношении насыпного объема сухих мелющих тел к объему суспензии клеток

1,7:1. При этом эа 5-10 мин дезинтеграции в раствор переходит 80-957 водорастворимых клеточных фракций в нативном состоянии, которые выделяются и очищаются известными методами.

Пример 1. Водную суспензию дрожжей Sacharomyces cerevisiae с концентрацией клеток 9,8 мас.Х, имеющую температуру 20 С и рН 8,4, однократно обрабатывают в лабораторном декомпрессионном дезинтеграторе периодического действия, состоящем из цилиндрической камеры — преобразователя высокого давления рабочей емкостью 35 мл, снабженной запорным клапаном, циклона †расширите и приемного сосуда. Суспензию помещают в камеру, насыщают сжатым азотом под избыточным давлением 9-10 МПа и после 25-секундного насыщения газом выстреливают через эапорный клапан в циклон-расширитель. Дезинтегрированную суспенэию собирают в прием1 29 1 603

Степень извлечения водорастворимого белка, Х рН

Шестикратная дезинтеграция

Однократная дезинтеграция

51 0

8,0

4,5

68,3

12,0

7,0

96,5

18, 1

9,0

11,0

124,0 24,9 ный сосуд и перерабатывают на однодисковом баллистическом вертикальном дезинтеграторе со скоростью вращения диска 180 м/с и стеклянными шариками диаметром 0,4-0,56 мм, отношение

5 объема суспензии к насыпному объему сухих шариков в деэинтеграторе 1: 1,7.

Эффективность дезинтеграции оценивают по выходу растворимого в воде белка в межклеточную среду. 10

Для сравнения проводят опыт, в котором биомассу обрабатывают только в баллистическом дезинтеграторе.

Кривые на чертеже изображают результаты дезинтеграции на баллистическом 15 дезинтеграторе в сравнении с предлагаемым способом в зависимости от времени, где кривая 1 — ход комбинированного дробления предлагаемым способом с одним предварительным дробле- 20 нием, кривая 2 — то же, с двумя предварительными дроблениями, кривая 3 то же, беэ предварительного дробления.

Как видно из чертежа в опыте с предварительной декомпрессионной дезинтеграцией практически весь водорастворимый белок переходит в раствор в течение 5 мин баллистической дезинтеграции; при баллистической дезинтеграции без предварительной декомпрессионной обработки для перехоЪ да в раствор того же количества водорастворимого белка требуется 24 мин.

Таким образом, предварительная де- 35 компрессионная дезинтеграция позволяет сократить время баллистической дезинтеграции на 21Х.

Пример 2. Опыт проводят на той же суспензии и в тех же услови- <О ях, что и в примере 1, но предварительную декомпрессионную дезинтеграцию проводят двукратно. Временной ход опыта и выход представлены кривой 2 на чертеже 1.

Пример 3. Водную суспензию дрожжей Sacharomyces cerevisiae c концентрацией клеток 15 мас.Х, имеющую температуру 50 С и рН 7,5, однократно обрабатывают в декомпрессионном деэинтеграторе при давлении 1920 MIIa. Остальные условия такие же, как в примере 1. Выход белка за тот же период времени 16Х к абсолютно сухому весу дрожжей (как в примере 1) .

Пример 4. Вместо суспензии дрожжей Sacharomuces cerevisiae дезинтеграции подвергают суспензию бактерий Methanomonas. Условия дезинтеграции такие же, как в примере 1.

Выход белка эа тот же период времени 19Х к абсолютному сухому весу бактерий.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет сократить время обработки клеток в баллистическом дезинтеграторе в 4-5 раз, если суспензия предварительно подвергалась декомпрессионной дезинтеграции. При этом значительно снижается степень нагрева суспензии, что приводит к повышению производительности баллистического деэиятегратора, экономии охлаждающей воды и энергии.

В случае выделения каких-либо термонеустойчивых фракций клеточного содержимого повышается их выход и сохраняется активность. Применение предлагаемого способа позволяет выделять клеточные энзимы в активном состоянии, например внутриклеточную нуклеазу и испольэовать ее далее для разрушения нуклеиновых кислот, содержащихся в клетках микроорганизмов.

Признано изобретением по результатам экспертизы, осуществленной Ведомством по изобретательству Чехословацкой Социалистической Геспублики.

1291б03 ео Я ю С: ео с, .ц- а джяоб ЭО OXh О ОИГОЭЯ

Составитель В.Глимбет

Техред М.Ходанич Корректор В.Бутяга

Редактор Н. Егорова

Заказ 204/29

Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

it3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4