Способ окрашивания спор бактерий

 

Изобретение относится к микробиологии , а именно к способам окрашивания спор бактерий. Целью изобретения является упрощение способа. Способ заключается в следующем. К суспензии спор бактерш Bacillus anthra cis добавляют 0,2-1 объема краски следующего состава: акридиновый оранжевый 0,5-1 г, спирт-ректификат 96° 10-20 мл, 1%-ный раствор едкого калия 1 мл, 5%-ный отвар шелухи лука репчатого 30 мл, вода дистиллированная до 100 мл. Смесь спор с краской нагревают до 70-90 0 и выдерживают 15-30 мин. Отмывают центрифугированием , готовят раздавленную каплю или мазки и микроскопируют в люминесцентном свете. Споры бактерий Bacillus anthracis окрашиваются в красно-оранжевый цвет на общем зеленом фоне. Посторонние частицы - в желтый. Окраска спор проста и прочная. Способ может быть использовано в полевых условиях . о (Л оо ОО со to Oi

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1339126 А 1 (5D 4 С 12 N 3/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОЬ У СВИДЕТЕЛЬСТВУ ловиях.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4004157/30-13 (22) 21. 10.85 (46) 23.09.87. Бюл. Р 35 (71) Украинский научно-исследовательский ветеринарный институт (72) А.И.Завирюха и Б.Л.Троценко (53) 576.8 (088.8) (56) Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований, )968, с. 44-45.

Ветеринария. — Киев, 1965, вып. 7, 143. (54) СПОСОБ ОКРА1ЦИВАНИЯ СПОР БАКТЕРИЙ (57) Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам окрашивания спор бактерий. Целью изобретения является упрощение способа. Способ заключается в следующем. К суспензии спор бактерий Bacillus anthra

cis добавляют О, 2-1 объема краски следукяце го состава: акридиновый орано жевый О, 5-1 г, спирт-ректификат 96

10-20 мл, 17-ный раствор едкого калия 1 мл, 57-ный отвар шелухи лука репчатого 30 мл, вода дистиллированная до 100 мл. Смесь спор с краской нагревают до 70-90 С и выдерживают

15-30 мин. Отмывают центрифугированием, готовят раздавленную каплю или мазки и микроскопируют в люминесцентном свете. Споры бактерий Bacillus

anthracis окрашиваются в красно-оранжевый цвет на общем зеленом фоне. Посторонние частицы — в желтый. Окраска спор проста и прочная. Способ может быть использовано в полевых ус20

),О

20,0

1 133912

Изобретение относится к микробиологической промьппленности, а именно к способам окрашивания люминесцентными красителями спор бактерий, в част,) ности Bacillus anthracis при изучении процессов их вегетации, распределения спор в организме животного и др., в тех случаях, когда необходимо осуществлять визуальный контроль аа 10 спорами, в том числе возбудителями сибирской язвы.

Целью изобретения является упрощение способа за счет использования обычных широкодоступных люминес- 15 центных красителей акридинового ряда.

Пример 1. Споровую культуру

Bacillus anthracis СТИ смывают с поверхности ИПА физиологическим раствором. Суспензию спор (100 млн

1 млрд/мл по оптическому стандарту мутности ВГНКИ ) разделяют ня две части. К одной части добавляют pQBkIbkkk объем 17.-ноro водноro раствора акри— динового оранжевого, к другой — 17ный водный раствор изотиоцината. Оставляют для окрашивяния на 30-40 мин.

Суспензию спор отмывают от краски центрифугированием (3000-5000 об/мин, 15-20 мии ) в дистиллированной воде

4-5 раз. Из взвеси спор готовят мазок, высушивают, фиксируют на пламени горелки и просматривают под иммерсией (об. 90 х 1 в люминесцентном микроскопе. Споры имеют вид слегка

35 желтоватых очень слабо светящихся зерен, плохо различаемых ня общем фоне поля зрения микроскопа (окрашивяние спор известным способом ).

Пример 2. К суспензии спор добавляют О, 5-1 объем краски следующего состава, мл:

Акридиновый оранжевый

Спирт-ректификат

96 -ный

Водный ра створ

КОН 1 7-ный 1,0

Вода дистиллированная до 100 мл

Подогревают до начала кипения, снимают со спиртовки и выдерживают

10-20 мин. Споры отмывают центрифугированием в 5-6 сменах дистиллированной воды. После отмывки из суспензии

55 спор готовят раздавленную каплю или мазок, который фиксируют на пламени и просматривают под иммерсией (об.

90x) в люминесцентном микроскопе.

Недостатком данного способа является то, что споры окрашиваются не— равномерно и часто скопление спор трудно отличить от принявших краску посторонних частиц (кусочки агара и др. ) . .Более 907 проваренных спор теряют способность к вегетации.

Окрашенные данным спо со бом спо ры слабо удерживают краску. В специальных опытах при попадании окрашенных спор в организм животных, имеющих прозрачное тело, отданная стенкой споры краска окрашивает органоиды и включения тела живо тно го, ко то рые трудно отдифференцировать под микроскопом от самих спор.

Пример 3. К суспензии спор

Вас. anthracis СТИ добавляют 0,2-1 объема краски следующего состава, 20,0 мл .

Акридиновый оранжевыйй 1,0

Спирт-ректификат о

96 -ный

17-ный раствор едкого калия 1,0

57.-ный отвар шелухи лука репчато го 30,0

Вода дистиллированная До 100

Приготовление отвара шелухи лука.

Шелуху лука репчатого подсушивают и измельчают в кофемолке, ступке или др. Навеску 5 r вносят в мерную колбу и заливают дистиллированной водой до метки 100 мл. Оставляют при комнатной температуре для холодного экстрагирования на 20-30 мин — 24 ч и помещают в кипящую водяную баню на

20-30 мин. Фильтруют и используют по назначению.

Смесь спор с краской нагревают до

70-90о и выдерживают 15-30 мин ° Отмывают центрифугированием в 4-5 сменах дистиллированной воды, готовят раздавленную каплю или мазки и микроскопируют под иммерсией в люминесцентном свете.

На общем зеленом фоне красно-оранжевые споры Вас. anthracis. Посторонние частицы окрашиваются вжелтый цвет и хорошо отличимы от спор. Контрольный посев на ИПА дал пашный рост колоний Bac anthracis СТИ.

Г>ыли испытаны влияния различных концентраций (0,2-10, 07) отвара шелухи лука репчатого в составе указанной краски. Показано, что наиболее

1339126 формула изобретения

Акридиновый оранжевый

Спирт-ректификат

96 -ный

17-ный раствор ед0,5-1,0 г

l0-20,0 кого калия

57-ный отвар шелухи лука репчатого

Вода дистиллированная

30,0

До 100

Составитель Т.Полянская.

Техред М,Дидык Корректор И. Эрдейи

Редактор A.Íàíäîð

Заказ 4183/17 Тираж 499 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ярко окрашивают споры и наиболее прочно краска уде рживае тся их стенкой при добавлении 20-30 мл 57-ного отвара. Снижение концентрации отвара

5 или уменьшение его количества ухудшает качество окраски. Увеличение концентрации или количества отвара не улучшает качество окраски.

При введении спор в организм жи- 1ð вотных, имеющих оптически прозрачное тело, споры остаются интенсивно окрашенными в течение 36 ч (срок наблю— дения ).

Пример 4. Споры окрашивают 16 по методике примера 3, но вместо подогрева до 70-90 их кипятят 1030 мин. При данном режиме споры также интенсивно окрашиваются, но 80—

957 из них теряют способность к ве- 20 гетации.

Экономическая эффективность предлагаемого способа окраски спор микроорганизмов заключается в том, что используются широко доступные обычные 25 люминесцентные красители акридинового ряда, например акридиновый оранжевый и другие реактивы: спирт, едкий калий, шелуха лука репчатого, всегда имеющиеся в обычной лаборатории. 30

Окраска спор довольно простая и прочная, поэтому дает возможность проводить специальные опыты по изучению вегетации спор, с контролем данного процесса в люминесцентном свете.

Предлагаемый способ также может быть использован при изучении и диагностике сибирской язвы в полевых условиях.

Способ ок рашивания спор бак терий путем нанесения красителя с последующим нагреванием мазка препарата и выдерживанием, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью упрощения способа, в качестве красителя используют смесь следующего состава, мл:

1 о нагревание осуществляют до 70-90 С, а выдерживание — в течение 20-30 мин.