Способ получения посевного материала для культивирования грибов рода aspergillus, продуцирующих экзоферменты
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу пот лучения ферментов с помощью микромицетов - грибов рода Aspergillus. Целью изобретения является повьшение выхода посевного материала, сокращение времени культивирования, повышение активности ферментов. Способ заключается в том, что агаризованную среду (например, сусло-агар) засевают культурой гриба рода Aspergillus (например, А. awamori F-122, А. ja- poriieus 2632-D, А. foetidus М-45), выращенной на сусло-ari pe, и культивирование проводят при облучении светом люминесцентных ламп ЛК-65 с AioKc 670 нм и интенсивностью освещения 3,8-4,6 Вт/м при температуре . 27-33°С в течение 2-7 сут. Полученный споровый материал вносят в производственную среду и процесс культивирования проводят на качалке в течение 3-8 сут. По окончании процесса получают на третьи сутки выращивания до 2-10 спор/см. Активность ментов составляет: целлобиазная 12,2- 17,3 ед/мл, эндоглюканазная 0,38- 0,42 ед/мл, целлобиогидролазная 0,85- 0,92 мг глюкозы/мл, пектолитическая 9,5-9,9 ед/мл, экзоглюкозидазная 0,28-0,31 ед/мл , экзополигалактуроназная 130-140 ед/мл. В зависимости от продолжительности ферментации можно осуществлять направленный биосинтез ферментов. Способ позволяет значительно усилить процесс спорообразования , не увеличивая объема питательной среды, упростить процесс культивирования и повысить активность ферментов . 11 табл. (Л со ел
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ госуда стаенный номитет
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И (ЛНРЫТИЯМ
nPH rHHT СССР (21),4235510/31-13 (22) 24.04.87 (46) 07.01.89. Бюл. Кр 1 (71) Институт микробиологии АН СССР и Всесоюзный научно-исследовательский,, биотехнический институт (72) Е.П.Феофилова, М.В.Волохова, Б.А.Величко, М»В.Полотебнова, В.М,Терешина, Е.A.ØèðîêoBà и М.В.Дараган-Сущова (53) 577.15(088.8) (56) Автррское свидетельство СССР
11 339191, кл. С t2 N .13/00, 1971.
Авторское свидетельство СССР
В 668941, кл. С 12 N 9/34, 1977. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОСЕВНОГО МАТЕ-.
РИАЛА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГРИБОВ РОДА
ASPERGILLUS, ПРОДУЦИРУЮЩИХ ЭКЗОФЕРМЕНТЫ (57) Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу по1 лучения ферментов с помощью микромицетов — грибов рода Aspergillus. Целью изобретения является повышение выхода посевного материала, сокращение времени культивирования, повышение активности ферментов. Способ заключается в том, что агаризованную среду (например, сусло-агар) засеваЛ „„ !449584 А 1 оп 4..С 12 N 13/00 3/00 //
//(С 12 N 13/00, С 12 R 1:66) ют культурой гриба рода Aspergil lus (например, А. awarrrori F-122, А. j aponieus 2632-D, А. foetidus Ì-45), выращенной на сусло-агаре, и культивирование проводят при облучении светом люминесцентных ламп ЛК-65 с
9 „ = 670 нм и интенсивностью освещения 3,8-4,6 Вт/м2 при температуре
27-33 С в течение 2-7 сут. Полученный споровый материал вносят в про- изводственную среду и процесс культивирования проводят на качалке в течение 3-8 сут. По окончании процесса получают на третьи сутки выращивания до 2 ° 10 спор/см . Активность фер а ментов составляет: целлобиазная 12,2". Я
17,3 ед/мл, эндоглюканазная 0,380,42 ед/ил, целлоаиогидролаеная 0,85. Q)
0,92 мг глюкозы/мл, пектолитическая
9,5-9,9 ед/мл, экзоглюкозидазная
0,28-0,31 ед/мп, экзополигалактуроназная 130-140 ед/мл. В зависимости от продолжительности ферментации мож- физо но осуществлять направленный биосин» ф тез ферментов. Способ позволяет зна- р чительно усилить процесс спорообразо- цр вания, не увеличивая объема питательной среды, упростить процесс культивирования и повысить активность ферментов. 11 табл.
1449584
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения ферментов с помощью микромицетов грИбов рода Aspergillus.
Цель изобретения - повышение выхода посевного материала, сокращение времени культивирования, повышение активности ферментов. Твердую среду (например, суслоаг р) засевают культурой гриба рода
As ergillus, выращенной на сусло-araре и культивирование проводят при об учении светом люминесцентных ламп
ЛК 65 с Э „ = 670 нм и интенсив- 15 но тью освещения I = 3 .8-4,6 Вт/м» пр 27-33 С в течение 2-7 суток. Полу енный споровый материал в количе.ст е 7 ° 10 спор в 1 мл среды вносят
s в рбиэводственную среду и процесс 20 ку ьтивирования проводят на качалке в ечение 3-8 суток. После окончания . п цесса получают на третьи сутки вь ащивания по предлагаемому способу до 2,0 10 спор/см . Активность фер8 ме нтов составляет, ед/мл: целлобиазн я 12,2-17,3, эндоглюканазная 0,380,,42; целлобиогидролазная 0,85-г
О,;92 мг глюкозы/мл, пектолитйческая
9,,5-9,9, экзоглюкозидазная 0,28-0,31, 30 э зополигалактуроназная 130-140. В з висимости от продолжительности ферм нтации можно осуществлять направ. л нный биосинтез ферментов. Например, д я А, awamori на пятые сутки культи- 35 в рования получают более высокую целл биазную активность (10,2 ед/мл), н шестые — эндоглюканазную (1,8 ед/
/йл).
Уменьшение интенсивности светово- 40 гф потока ниже 3,8 Вт/м снижает выход спорового материала. Например, ля А. j aponicus на четвертые сутки выращивания спорового материала вмест4 (140™145) 10 спор получают 90 х 45 х 10 спор при снижении I с 4,2 до
3 5. BT/ì . (табл. 1 и 3) . Как,следствие, снижается активность получаемых ферментов. Так, например, целлобйазная активность при .продолжительности ферментации в течение восьми суток при использовании посевного материала, выращенного под действием освещения с I = 3,5 Вт/м, нф 30-353 ниже, чем при оптимальном варианте воздействия света на посев ной материал.
Увеличение интенсивности светово- . го потока больше 4,6 Вт/м также снижает выход спорового материала. Так, увеличение до 4,9 Вт/м уменьшает количество получаемых спор на четвертые сутки выращивания до (45 50) х 10 спор/см,вместо (140-145) х х 10 спор/см при I = 4,2 Вт/м
6 (табл. 1 и 4), Как следствие, активность целлобиазы снижается на 20-25Х.
Оптимальной температурой для получения спорового материала является
= 27-33 С, Выход -спор при. этом для б
А. j aponicus (15-18) ° 10 спор на
1 см на вторые сутки культивирования. Повышение и понижение температуры культивирования (выше 33 и нио же 27 С) приводит к снижению выхода о спор. Например, при t = 20 С на вто" рые сутки спор не образуется, при
24-25 С образуется, 3,5-4,5 спор в на 1 см, при t = 35-36 С на вторые сутки культивирования образуются единичные споры.
Используемые в. настоящее время продуценты ферментов (А. japonicus, A. awamori, А. foetidus) имеют различную скорость процесса спорообразования. В указанных условиях два первых продуцента образуют споры уже на вторые сутки выращивания. У А. foetidus образование спор происходит в более поздние сроки выращиваниями и споровый материал собирают соответственно на пятые-седьмые сутки, Таким образом, указанный интервал выращивания спорового материала (27 суток) объясняется различной способностью трех взятых продуцентов к накоплению спорового материала.
В связи с тем, что в известном способе количество посевного материала рассчитано на 1 r воздушно-сухой культуры, а в предлагаемом — в общепринятых в настоящее время единицахколичество спор в 1 см среды, введен коэффициент пересчета, соответствую" щий 0,01. По известному способу на седьмые сутки культивирования А. awamori получают 5 5 10 спор на 1 г
9 воздушно-сухой культуры, что в пересчете на 1 см среды составляет 5,5 х х 10 " спор. По предлагаемому способу уже на третьи сутки получают 2 х х 10 спор в 1 см среды.
Пример 1. Мицелий А, japonicus (хранится в BKNF Р 2632-Д) выращивают на косяках с сусло-агаром в течение шести суток при t 30 С до обильного спороношения. Для полу1449584
ТаблицаЗ
1,6 ° 10
5 10, Количество спрр/см по способу
Время от начала выращивания посевного матери ала, сут
25 известному предлагаемому
3 10 18 10
Время от начала выращивания
40 посевного материала, сут
1,2 10
1,3 10
9,0
13i0
17,3
3 8 чения посевного материала твердую всреду, например сусло-агар или.известную среду, засевают споровой суспензией, смытой с косяков сусло-агара. Выращивание спорового материала проводят при t = 30 С в течение четырех суток при постоянном освещении люминесцентными лампами ЛК-65 с
Ъ„„„= 670 нм и интенсивностью освещения 4,2 Вт/м .
В качестве контроля используют посевной материал, полученный по известному способу..
Результаты выращивания посевного материала по известному способу и по предлагаемому, разница в количестве получаемого посевного материала наглядно представлены в табл. 1. .Таблица1 (60-55) 10 (80-90)*10 6
90 10 (140-145) х х 10 тивированнь светом трехсуточный посевной материал. в количестве
7 10 спор/см вносят в жидкую пита5 тельную производственную среду состава, Х: "свекловичный жом 4, пшеничные отруби 0,5; солодовые ростки
1,43; КН Р04. 0,2," Ng804 0,06; (NH ) S0z 0,6. Культивирование про водят на качалке работающей со скоо ростью 190 об/мин при t = -Зц в те-. чение восьми суток.
Различие в активности ферментов в зависимости от получения посевного материала по известному и предлагаемому способам представлено в табл. 2, Т а б л и ц а 2
Пример 2. То же, что пример 1, но для получения посевного материала используют освещение мицелия светом с Х = 3,5 Вт/м .
Различие в количестве получаемого посевного материала при выращивании по известному способу и по предлагаемому, но при I = 3,5 Вт/м, пред10 ставлено в табл. 3.
Время от Количество спор/см по
15 начала вы- способу ращивания посевного известному предлагаемому материала, сут
2 0 (45-50) 10 (30-35) 10 (75-85). 10 90 l0
Пример 3. То же, что пример 2, но для получения посевного материала используют интенсивность светового
З0 потока I = 4,9 Вт/м .
Различие между количеством спор, полученных по известному способу и по предлагаемому, но при I = 4,9 Вт/м представлено в табл. 4.
Таблица4
Количество спор/см по способу известному предлагаемому
\ (30-35) 10 (50-65) 10 (63"78) "10 (45-50) 10
Таким образом, для получения ожидаемого эффекта (увеличения выхода посевного материала по предлагаемому способу) интенсивность облучения выращиваемого посевного материала должна лежать в пределах 3,8-4,6 Вт/м .
Пример 4. То же, что пример 1, но .используют штамм А, avamo"
ri (хранится в коллекции культур
ВНИИГенетика Р F-122) и для засева
449584
Hpoposwes< Время от начала Фермен- тации, сут Вр на ра пос мат от а выания нного риала, ут 8,5 Таблицаб Вре я от начала фер ентации, сут звестному предлагаемому Целлобиазная 10,2 12,2 Эндоглюканаэная 0.,19 0,24 0,33 0,42 Таблица 8 Время от начала выращива» ния по» севного материала, сут Таблица 7 тивность ед/мл (6) р по способу Время от нача а ферментаЦии, сут Экзоглюкоэидазная 0,25 0,31 Эндоглюканаэная 1,1 4 1,2 5 1 жидкой питательной среды берут двухсуточный посевной материал, облученный светом. Различие между количеством получае ых спор и активностью ферментов, получаемых по известному и предлагаемо у способам, представлены в I таб, 5 и 6 соответственно. Т а б л и ц а 5 Количество спор/см по способу известному предлагаемому (10-20) -10 (60-70) 10 20 (30-60) 10 (100-200) ° 10 тивность ед/ (6) у 25 по способу 1 р и м е р 5. То же, что пример 4, но для засева производственной жщ кой питательной среды берут трех" 4О суточный посевной материал, активирЬЦанный светом. Различие между активностью Ферментов, полученных по известному спосо-. бу и предлагаемому, представлено в табл. 7. » 4» известному предлагаемому ° \»«»Ф« Активность, ед/мп (6), по способу известному предлагаемому Целлобиогидролазная, мг глюкозы/мл (7) О,66 О 92 Целлобиазная 5,9 10,2 Из примера 5 следует, что выращивание посевного материала в условиях освещения не только увеличивает активность ферментов, но и способствует их направленному биосинтезу. Так, на пятые сутки Ферментации ..можно получить наиболее высокую целлобиазную активность, на шестые — зндоглюканазную (табл. 7), Пример 6. То же, что пример 1, но только используют кулвтуру, гриба А. foetidus (хранится в коллекцич ВНИИГенетика М-45) и для засева жидкой питательной среды берут пятисуточный посевной материал, облученный светом, I Различия между количеством получаемых спор н активностью Ферментов получаемыми по известному способу и предлагаемому, представлены в табл. 8 и 9 соответственно. Количество спор/см по способу известному предлагаемо му (G,0G5-0,007)õ.(2,О-2, 5) х х 10 х IG (О, 2-0,3) 10 (2,3-3,9) 10 (0,17-0,4) 10 (5,5-5)0) 10 1449584 Таблица9 известному .предлагаемому 160 1,00 15 ки выращивания и упрощает процесс Т а б л и ц а 10 Время от начала ферментации, сут Активность, ед/мл (8), по способу т 25 известному предлагаемому Пектрлитическая 7,0 8,8 Экзополигалактураназная 72,0 78,0 35 Таблица11 Активность, ед/мл (8), по способу Время от начала ферментации, сут Р известному предлагаемому Пектолитическая 9,3 9,9 Эндополигалактуронаэная 105 120.6 с 90 149 ВШ111ПИ Заказ 6934/28 Тираж 520 Подписное Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Время от нача- Эндополигалактуранаэла ферментации, ная активность, ед/мл, сут по способу Пример 7. То же, что пример 6, но для засева жидкой питательной среды берут шестисуточный посевной материал „облученный светом. Различие между активностью ферментов, полученных по известному способу и по предлагаемому, представлено в табл. 10. Н р и м е р 8, То же, что пример 5, но для засева жидкой производственной среды используют семисуточный посевной материал. Различие между активностью ферментов, полученных по известному способу и по предлагаемому, представлено II TB6JI 11 ° 10 Таким образом, по известному способу для А. awamori на шестые-. седьмые сутки получают 5,5 10 спор на 1 см или 5,5 10 спор в 1 г воздуш9 но-сухой культуры, По предлагаемому способу уже на третьи сутки получают 2 ° 10 спор/см, для А. japoIIicus на вторые сутки в 5-6 раз больше спорового материала и на . третьи сутки в 1,5-2 раза, для А. foetidus — .на шестые сутки в 8-11 раз и на седьмые сутки в 14-15 раз. Предлагаемый способ сокращает срокультивирования, так как отсутствует стадия предварительного подращивания в течение 12 ч. Кроме того, получают более активные ферменты и осуществляют .их направленный биосинтез. Например, на пятые сутки ферментации можно, получить, используя трехсуточный посевной материал А, awamor наиболее высокую целлобиазную активность, на шестые сутки — эндоглюканазную . У трех грибов — продуцентов экзоферментов рода Aspergillus удается значительно усилить процесс спорообраэования, не увеличивая объема питательной среды, и получать большие количестна посевного материала, например для А. foetidus в 14-15 раз больше, чем в известном способе, а также упростить процесс культивирования и повысить активность экзоферментов. Формула изобретения Ф Способ получения посевного материала для культивирования грибов рода Aspergi11us, продуцирующих экзоферменты, включающий посев мицелия продуцента на твердую питательную среду и выращивание до обильного спрроношения с последующим активированием культуры, отличающийся тем, что, с целью повьппения выхода посевного материала, сокращения времени культивирования и повышения активности ферментов, активирование культуры осуществляют облучением светом с % = 670 нм, интенсивностью освещения 3,8-4,б Вт/м при температуре 27-33 С в течение 2-7 сут, 
