Способ получения человеческого инсулина или его аналогов

 

Изобретение касается полипёптидов, в частности человеческого инсулина (ИН) и его аналогов, которые как биологически активные соединения используют в медицине. Для упрощения получения ИН используют другие восстанавливающие агенты. Синтез ИН ведут из сульфонатов А-цепи (А-ц) и Б-цепи (Б-ц) человеческого ИН или его аналогов в водной среде при общей концентрации белка в растворе 5-10 мг/мл, массовом соотношении А-ц/В-ц(1-2):(1,5-1), рН 9-11,5 и 0-22 С (0,5-24 ч) в присутствии тиолового восстанавливающего агента. Последний выбирают из группы: дитиотриетола, дитиоэритрола, меркаптоуксусной кислоты, -меркаптопропионовой кислоты или цистеина, и берут в количестве 8-15 мас.% от общего количества А-ц и Б-ц. Способ обеспечивает выход ИН до 25% с проведением процесса в одном аппарате в однофазном растворителе. 2 табл. О)

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) А3

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н IlATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3269596/23-04 (22) 26.03.81 (31) 134390 (32) 27.03.80 (33) Us (46) 30.07.87 ° Бюл. N- 28 (71) эли лилли энд компани (Us) (72) Рональд Юджин Чанс и Джеймс

Артур Хоффманн (US) (53) 547.964.4.07(088.8) (56) Dixon G.Н., Wardlaw А.С. Regenesation of insulin activity from

the separated and inactive А and

В Chains — Nature, 1960, 188, 721-724. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО

ИНСУЛИНА ИЛИ ЕГО АНАЛОГОВ (57) Изобретение касается полипептидов, в частности человеческого инсулина (ИН) и его аналогов, которые (sD 4 С 07 К 7/40//А 61 К 37/02 как биологически активные соединения используют в медицине. Для упрощения получения ИН используют другие восстанавливающие агенты. Синтез ИН ведут из сульфонатов А-цепи (А-ц) и

В-цепи (В-ц) человеческого ИН или его аналогов в водной среде при общей концентрации белка в растворе

5-10 мг/мл, массовом соотношении

А-ц/В-ц=(1-2):(1,5-1), рН 9-11,5 и

0-22 С (0,5-24 ч) в присутствии тиолового восстанавливающего агента.

Последний выбирают из группы: дитиотриетола, дитиоэритрола, меркаптоуксусной кислоты, Р -меркаптопропионовой кислоты или цистеина, и берут в количестве 8-15 мас.X от общего количества А-ц и В-ц. Способ обеспечивает выход ИН до 257 с проведением процесса в одном аппарате в однофазном растворителе. 2 табл.

1 13

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения человеческого инсулина или его аналогов биологически-активного соединения, которой находит применение в медицине.

Цель изобретения — упрощение процесса и повьппение выхода целевого продукта.

Пример 1. S-сульфонат А-цепи свиного инсулина (360 мг) растворяют в 36 мл 0,1М глицинового буфера (рН 10,5) и рН смеси доводят до 10,5 с помощью 5 í. NaOH. S-сульфонат В-це пи свиного инсулина (300 мг) растворяют в 30 мл 0,1М глицинового буфера (рН 10,5) и доводят рН смеси до 10,5 с помощью 5 н. ИаОН. Дитиотриетол (ДТТ) (123,4 мг) растворяют в 4 мл

0,1М глицинового буфера (рН 10,5) и рН смеси доводят до 10,5 с помощью

0,2 мл 5 í. NaOH.

Растворы А- и В-цепей соединяют в смесь объемом 100 мл при комнатной о температуре (- 25 С), а затем добавляют 1,91 мл дитиотриетола (ДТТ) для обеспечения соотношения -$Н -SSO

1,04. Получающийся раствор осторожно перемешивают в открытом химичеcKoM стакане магнитной мешалкой при темо пературе 4-8 С в течение 20 ч. Анализ с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения указывает на то, что выход инсулина составляет

193,8 мг, т.е. 297. от общего количества белка.

40 мл этого раствора довели до рН 3,15 с помощью уксусной кислоты.

Смесь подвергали гель-фильтрации на колонке Сефадекс G-50 (Суперфайн, Superfine) размерами 5х200 см, урав— новешивали и элюировали iM уксусной о кислотой при 4-8 С. Фракции, содержащие инсулин (объем элюции около

2450-2700 мл), объединяют и лиофилизируют с извлечением 95 мг инсулина, что составляет 25Х от общего количества белка. Свиной инсулин по данным электрофореза в полиакриламидном геле, аминокислотного анализа, инсулин-радиорецепторного анализа, жидкостной хроматографии и восстановления глюкозы в крови кроликов достаточно чистый продукт.

Пример 2. Приготавливают растворы S-сульфонатов А- и В-цепей бычьего инсулина концентрацией 5 мг/мл в 0,01М глицинового буфера (рН 10,5) 27790

2 рН каждого раствора доводят до 10,5 с помощью 5 н. NaOH. ДТТ (61,7 мг) растворяют в 4,0 мл 0,1М глицинового буфера (рН 10,5) и рН доводят до 10,5 с помощью О, 15 мл 5 н. NaOH. К 0,5 мл раствора В-цепи добавляют 0,8 мл раствора А-цепи и 0,035 мл раствора

ДТТ при комнатной температуре (25 С)

iD для обеспечения соотношения -SH -SSO к з

0,91. Получающийся раствор перемешивают при 4-8 С в течение 4 ч в открытом флаконе. Анализ смеси с помощью

ЖХВР показал, что выход бычьего инсулина составляет 1,96 мг или 307 от общего количества белка.

Пример 3. Приготавливают растворы S-сульфонатов А- и В-цепей бычьего инсулина, имеющие концентрацию 10 мг/мл, в 0,1 М глициновом буфере (рН 10,5). рН каждого раствора доводят до 10,5 с помощью 5 H. NaOH.

ДТТ (61,7 мг) растворяют в 2,0 мл воды, дистиллированной в стекле. К

2б 0,5 мл раствора В-цепи добавляют

0,6 мл раствора А-цепи и 29,25 мл раствора ДТТ при комнатной темпера- туре (25 C) для обеспечения соотношения -SH SSO, 1,00. Получающийся

30 раствор перемешивают при 4-8 С в открытом флаконе объемом 3 м в течение

20 ч. Анализ смеси ЖХВР показал, что выход свиного инсулина составляет

3,81 мг или 357 от общего количества

35 белка.

Пример 4, Приготавливают растворы S-сульфоната В-цепи человеческого (панкреатического) инсулина и нескольких S-сульфонатов А-цепей

40 человеческих (панкреатическая и

Е.Coli) и свиных (панкреатических) инсулинов концентрацией 5 мг/мл в

О, 1М глициновом буфере (рН 10,5). рН каждого раствора доводят до 10„5

45 с помощью 5 í. NaOH. ДТТ (61,7 мг) растворяют в 4,0 мл 0,1М глицинового буфера (рН 10,5) и рН доводят до

10,5» добавляя 0,16 мл 5 í. NaOH. К

1,0 мл каждого раствора S-сульфона-. тов А-цепей добавляют 0,5 мл раствора S-сульфоната В-цепи и 0,05 мл раствора ДТТ при комнатной температуре (25 С) для обеспечения соотношения -SH -SSO i 09. Все растворы пек,»»

В5 ремешивают в прохладной комнате (4-8 С) в открытом флаконе в течение

20-22 ч. Затем их анализируют с помощью ЖХВР с использованием в качестве стандарта панкреатического человеческого инсулина для вычисления выходов4

Результаты приведены в табл. 1.

А-цепь

Человечес кий инсулин мг

Свиной (панкреатический) Свиной (панкреатический) 28,1

Человеческий (панкреатический) 1,95

Человеческий (панкреатический) 27,1

1,99

Человеческий

Пример 5. Приготавливают раствор каждого из S-сульфонатов Аи В-цепей человеческого инсулина концентрацией 5 мг/мл в О, 1М глициновом буфере (рН 10,5). рН каждого раствора доводят до 10,5 с помощью 5 í. NaOH °

ДТТ (61,7 мг) растворяют в 4, 0 мл

О, 1М глицинового буфера (рН 10,5) и рН доводят до 10 5 с помощью 0,16 мл 4р

5 н. NaOH. К 0,5 мл раствора В-цепи добавляют при комнатной температуре

1,0 мл раствора A-цепи, а затем 50 мл раствора ДТТ для обеспечения соотношения -SH„ -SSO равным 1,09. Получаю- 45 щийся раствор перемешивают при температуре 4-8 С в открытом флаконе объемом 3 мл в течение 22 ч, после чего анализ с помощью ЖХВР указывает на то, что выход человеческого инсулина равен 2,58 мг, что составляет

34Х от общего количества белка.

Пример 6. S-сульфонат А-цепи инсулина человека (328 мг) растворяют в 65,6 мл 0,1М глицинового буфера (рН 10,5) и рН смеси доводят до 10,5 с помощью 75 мл 5 н. NaOH. S-сульфонат В-цепи инсулина человека (164 мг) растворяют в 32,8 мл О, 1М глициновоз 1327790

ro буфера (рН 10,5) и рН смеси доводят до 10,5, добавляя в нее 15 мл

5 н. NaOH. ДТТ растворяют в 4,0 мл

О, 1М глицинового буфера (рН 10,5) и

Т а б л и ц а 1 рН раствора доводят до 10,5 с помо5 щью 5 и. ИаОН. выхода Растворы А- и В-цепей соединяют в по отноше- стеклянном стакане объемом 150 мл нню к об- fQ при комнатной температуре (25 С) и щему белку добавляют 3,28 мл раствора ДТТ для обеспечения соотношения -SH -SSO « S

1,09. Открытый стакан помещают в баню с ледяной водой в прохладной ком2,00 7 15 нате и энергично перемешивают в течение 36 мин. Затем раствор перемешивают в течение 24 ч в прохладной комо нате (4-8 C). Проведенный в этот мо2,11 мент анализ с помощью ЖХВР определили выход, равный 148 мг или ЗОХ от общего количества белка.

К 100 мл этого раствора добавляют

26,0 25 мл ледяной уксусной кислоты до тех пор, пока значение рН не стано26 вится равным 3,15. Весь материал подвергают гель-фильтрации на колонке

2,03 Сефадекса G-50 (Суперфайн) размером

5х200 см, уравновешенной и элюирован26,5 ной 1М уксусной кислотой при 4-8 С.

3р Все элюированные белки лиофилизуют, Пик инсулина (объем элюции 24652781 мл) весит 125 r и представляет

29,4Х извлеченного белка.

Часть инсулинового пйка (95,5 мг) растворяют примерно в 9 мл 0,01М трнс-0,001 ЭДТА-7,5М мочевины—

0,03 NaC1 буфера (рН 8,5 при 4 С).

Смесь подвергают хроматографии через ион-обменную колонку размером ,2,5х90 см ДЭАЭ-целлюлозы (диэтиламиноэтил), уравновешенную тем же самым буфером. Белок элюируется при .4-8 С градиентом концентраций NaC1

0,03-0,09М в объеме 1 л в том же самом буфере, а затем 1 л буфера, содержащего 1М NaC1 Каждый из пиков обессоливают на колонках Сефадекс

С-25 (грубых) в 2Х-ной уксусной кислоте и лиофилиэируют. Пик инсулина (объем элюции 878-1008 мл) весит

55,73 мг и составляет 84Х извлеченного белка.

Кристаллы цинк-инсулина получают растворением 11,90 мг пробы инсулинового (ДЭАЭ) пика в 240 мл 0,1 н.

НС1 с последующим быстрым добавлением 2,16 мл 0,04Х-ного раствора

ZnCl — 0,05М цитрата натрия — 15X ацетона в стеклянной центрифужной

0 6

5 132779 пробирке. Кристаллизация проходит в течение 72 ч при комнатной температуре (25 C), после чего супернатант извлекают и кристаллы дважды промывают в холодной воде с рН 6,1 с центрифугированием при 2000 об/мин при

3 С между промывками. Кристаллы повторно растворяют в 0,01 í. HCl для анализа.

Полученный препарат человеческо- 10

ro инсулина считают совершенно чистым после электрофореза в полиакриламидном. геле (одна линия), анализа аминокислот, инсулинового радиорецепторного анализа, инсулинового радио- 15 иммуноанализа, ЖХВР, дансилирования и УФ-спектроскопии. Анализ на крови кроликов давал активность, равную

26,3 1,8 ед. на мг безводного вещества. 20

Пример 7. Был приготовлен раствор S-сульфонат А-цепи человеческого Е.coli (N-формил-Гли ) инсулина.и раствор S-сульфоната В-цепи человеческого (панкреатического) инсу- 25 лина концентрацией 5 мг/мл в 0,01М глициновом буфере (рН 10,5). рН каждого раствора доводят до 10,5 с помощью 5 н. NaOH. ДТТ (61,7 мг) растворяют в 4,0 мг глицинового буфера 30 (рН 10,5). рН доводят до 10,5 с помощью О, 16 мл 5 H. NaOH. К 1,5 мл раствора S-сульфоната В-цепи добавляют 1,0 мл раствора ДТТ при комнатной температуре (25 C) для обеспечения соотношения -SH„-БЯО 1, 10. Раствор перемешивают в прохладной комнате (4-8 С). в открытом флаконе объемом

3 мл в течение 23 ч, после чего проводят анализ с помощью ЖХВР. Анализ показывает, что выход (N-формилГли-)-А человеческого инсулина равен

19,5Х от общего количества белка.

После подкисления до рН 3,15 с по- 45 мощью ледяной уксусной кислоты часть этого раствора подвергают гель"фильтрации на колонке Сефадекс С-50 (Суперфайн) размером 1,5х90 см, уравновешенной и элюированной 1М уксусной кислотой при 4-8 С. Пик (N-формилГли )-А человеческого инсулина (объем элюции 87-95 мл) собирают, берут из него аликвоту, а оставшуюся часть лиофилизируют. Белок считают чистым на основании анализа ЖХВР и аминокислотного анализа. Биологическую активность (N-формил-Гли )-А человеческого

I инсулина оценивают с помощью радиорецепторного анализа; активность составляет 17Х по отношению к стандарту человеческого инсулина.

Пример 8. Готовили раствор

А-цепи свиного S-сульфоната концентрации 10 мг/мл в О, 1 M глициновом буфере (рН 10,5) и такой же раствор

В-цепи человеческого S-сульфоната (Е.coli). А-В пул готовили, беря 2 мл раствора А-цепи на 1 мл раствора

В-цепи.рН А-В-пула устанавливали равным 10,5 с помощью 5 í. NaOH. Цистеин (121,2 мг) растворяли в 3,0 мл

0,1М глицинового буфера (рН 10,5) и устанавливали рН полученного раствора равным 10,5, добавляя к нему 0 35 мл

5 н. NaOH. К 1,4 мл А-В-пула добавляли при комнатной температуре 52 мкл раствора цистеина, в таком расчете, чтобы соотношение между -SH и -SSO

3 равнялось 0,95. Полученный раствор

Ь перемешивали при 4-8 С в открытой пробирке объемом 3 мл в течение

20 ч, после чего проводили анализ на

"пролактин" из плаценты человека. Выход инсулина человека составлял

3,25 мг (23,2Х от общего содержания белков).

Пример 9. Проведен рентгенографический анализ человеческого инсулина, полученного как полусинтетическим (NOVO) способом, так и способом рекомбинатной ДНК (LiLL ). Кристаллы человеческого инсулина имеют комбоэдрическую ячейку,пространственной группы R За=82,85 А, С =34,1 А и.почти изоморфны кристаллам 2-инсулина свиньи (a=82,50 А, С=34,0 А).

Точные фотографии кристаллов человеческого инсулина, полученного обоими способами, не отличаются друг от друга и от панкреатического человеческого инсулина, однако между человеческим инсулином и инсулином свиньи имеются заметные различия в распределении интенсивностей.

Тщательный кристаллографический расчет как МОЧО, так и LL инсулинов с использованием разрешения 1,9А, проведенный быстродействующим Фурьеметодом наименьших квадратов, показывает, что в пределах ошибки эксперимента структуры обоих человеческих инсулинов идентичны и очень близки к инсулину свиньи за исключением С-конца цепи В. После оптимизации различия в расположении атомов в человеческих инсулинах NOVO u LiLL состав790 8 ствительной концентрации белка в каждом образце.

Результаты, приведенные выше, показывают наличие реального, четкого оптимума до концентрации белка, равного 8мг/мл для реакции соединения цепей человеческого альбумина.

Исследование рН: соединение А+В цистеин.

Цель: оценка оптимального значения. рН для реакции соединения А+В+цистеин.

Методика: соединяют 15 мл раствора А-цепи и 5 мл раствора В-цепи в

0,1 М глициновом буфере с рН 10,5.

Раствор цистеина получают растворением 121,2 мг в 3,0 мл глицинового буфера и последующим доведением рН до 10,5 с помощью 350 мкл 5 í. NaOH.

Аликвоты указанного объединенного раствора А/В, имеющие объем по 1,4мл, доводят при комнатной температуре до указанных ниже значений рН. Прибавляют 57 мкл раствора цистеина, после чего рН сразу доводят до исходного значения. После этого каждый образец помещают в холодную комнату (6 С) и перемешивают в течение ночи в 3-миллилитровой .ампуле.

Результаты: был проведен ЖХВД-анализ через 24-27 ч проведения реакции при 6 С с использованием аликвот, разбавленных ледяной уксусной кислотой 1:2. Рассчитаны действительные выходы в реакции соединения цепей.

Зависимость от рН обнаруживает четкий оптимум около рН 10,5.

Вывод: в реакции соединения А+В+

+цистеин обнаружен четкий оптимум при рН 10,5.

Исследование рН: соединение А+В.

Цель: подробная оценка интервала рН около значения рН 10,5 в начале реакции соединения цепей А+В для определения критических отклонений в значении рН и точного значения оптимального рН, приводящего к оптимальному выходу инсулина.

Методика: 120 мг свиного А (ЯЯОЗ) и 60 мг человеческого В ($80 ), полученного из Е.со1 (trp E), растворяют соответственно в 12,0 и 6,0 мл

0,1 M глицинового буфера с рН 10,5 и снова доводят до рН 10,5 с помощью

5 н. NaOH.

61,7 мг ДТТ растворяют в 4,0 мп

О, 1 M глицинового буфера и снова доводят рН до 10,5 с помощью 140 мкл

5 н. NaOH.

7 1327 ляют: О, 15 А только для атомов основной цепи и 0,22 А для всех атомов.

Эти различия меньше, чем различия между двумя молекулами в димере 2

Zn-инсулине свиньи. Конформация боко- 5 вой лизиновой цепи В29 хорошо определяется для обеих молекул, причем в молекуле инсулина свиньи обнаружены две различные конформации. Атомы основной цепи ВЗО в обеих молекулах су- 10 щественно сдвинуты, в частности у карбоксильных групп. Обнаружены также изменения структуры воды при сравнении кристаллических структур человеческого инсулина и инсулина свиньи 15 в области В28-ВЗО.

Влияние концентрации белков на реакцию соединений цепей А-В.

Цель: подробная оценка оптимальной общей концентрации белковых це- 20 пей в реакции соединения цепей А+В инсулина человека. Методика: получают 7 мл раствора А (SSO> ) из свиньи с концентрацией 25 мг/мл и 4 мл раствора В (SSO ) из Е.coli (В-gal) с

9 „ концентрацией 25 мг/мл в 0,1М глициновом буфере с рН 10,5. 6,0 мл раствора А-цепи и 3,0.мл раствора В-цепи объединяют. Затем объединенный раствор доводят до рН 10,5 с помощью З0

5 н. NaOH. ДТТ получают растворением

61,7 мг в 4,0 мл 0,1М глицинового буфера с рН 10,5, и снова доводят до рН 10,5 с помощью 140 мкл 5 í. NaOH.

В объединенный раствор цепей А/В 35 прибавляют 1,64 мл раствора ДТТ.

Оптимальное соотношение SH/SSO =

=1,.20 было определено ранее с теми же ДТТ и цепями при концентрации белка, равной 10 мг/мл. Концентрация 40 белка в реакции соединения цепей А+В не должна существенно влиять на оптимальное содержание ДТТ.

Раствор в котором проводится ре- 45 акция соединения, сразу разделяют на аликвоты и помещают в 11 ампул емкостью по 3 мл, содержащих различные количества О, 1М глицинового буфера.

Каждую ампулу перемешивают в течение ночи при 5 С.

Действительная общая концентрация цепей учитывает данные аминокислотного анализа (88,8 мас.Ж А-цепи,88мас.X

В-цепи), а также добавление ДТТ и эа- 55 данные факторы разбавления. 1/27 ЖХВД— анализ проводят сразу после проведения реакции в течение 22-25 ч. Данные по выходу рассчитывают на основе дей9 132779

Укаэанные растворы хранят в упаковке из льда в течение подготовки индивидуальных реакционных образцов.

Каждый образец полностью завершают до того, как начинают подготовку сле-,5 дующего образца.

Следующий эксперимент проводили прибавлением реагентов в заданном порядке в открытые 3-миллилитровые ампулы и перемешиванием в холодной ком- 10 нате (6 С) с помощью магнитной мешалки.

Доведение рН проводят быстро и . очень точно. Перечисляемые ниже результирующие значения рН представляют собой точные исходные значения о рН при 6 С, при которой реакцию начинают и проводят.

Результаты: после проведения реакции в течение 4-5 ч несколько образцов подвергнуты прямому анализу с помощью ЖХВД. После проведения реакции в течение 1 дня все образцы были подвергнуты анализу с помощью ЖХВД.

Данные ЖХВД, рассчитанные относительно ЖХВД-анализа стандартного инсулина свиньи.

Приведенные данные ясно показывают, что рН 10,5 соответствует оптимуму для начала проведения реакции соединения А+В.

Проведенные опыты показывают, что рН является крайне важным фактором, определяющим хорошие выходы инсулина. Первоначальный рН, равный 10,5, 35 при данной температуре реакции должен соблюдаться во всех других реакциях соединения.

Для получения максимального выхода инсулина нет необходимости далее "0 поддерживать первоначальный рН реакции, равный 10,5.

Эксперимент по проведению реакции соединения свиной цепи А (SSO )4 че- 45 ловеческой цепи В (SSO ) обнаруживает 6 достаточно воспроизводимых выходов реакции соединения: 23,6;

24,7; 23,5; 23 р0; 23,0 и 23, 1Ж со средним выходом 23,5 . 50

Выводы: этот эксперимент ясно показывает, что оптимальным значением рН является 10,5, а также что в реакции соединения А+В исходное значение рН играет решающую роль. 55

Реакция соединения А+В и цистеин (ЦИС).

Цель: определить, можно ли использовать аминокислоту цистеин в качест0 ве восстанавливающего тиол недорогого агента в реакции соединения цепей

А+В. Методика: свиную А (SSO )„ и Е.coli В (SSO ) используют для получения смешанного раствора А/В с концентрацией 10 мг/мл в глициновом буфере с рН 10,5.

Раствор L-цистеина в форме свободного основания (м.в.=121,16} получают растворением 121,2 мг в 3,0 мл

О, 1 М глицинового буфера, после чего рН доводят до 10,5 с помощью

350 мкл 5 í. NaOH.

Различные количества цистеина прибавляют к 1,4 мл аликвотам смешанного раствора А/В при рН 10,5. Через

17-21. ч проведения реакции при 6 С проводят ЖХВД-анализ.

Результаты: получена зависимость от SH/SSO, типичная для многих зависимостей для ДТТ. Оптимальный выход, равный 23,3 ., хорошо сравним с выходом белка, равным 24-27 и получаемым с ДТТ. Оптимальные выходы. как для ДТТ, так и для цистеина, получены при одинаковом соотношении

БН/БИО, =1, 2.

Выводы: в реакции соединения цепей А+В цистеин работает также, как

ДТТ.

Реакция соединения А+В с меркаптопроционовой кислотой и с меркаптоянтарной кислотой, Цель: определить, можно ли использовать Р -меркаптопропионовую кислоту (сокращенно МПК) или меркаптоянтарную кислоту (сокращенно МЯК) в качестве восстанавливающих тиол агентов в реакции соединения цепей А+В.

Методика: свиную А (SSO )4 и Е.coli (SSO ) используют для получения смешанного раствора A/Â с общей концентрацией 10 мг/мл в глнциновом буфере с рН 10,5. Для каждого образца используют по 1,4 мл этого смешанного раствора А/В. -Меркаптопропионовую кислоту используют в виде раствора 87 мкл этой кислоты в 4,0 мл глицинового буфера, причем рН доводят до 10,5 с помощью

200 мкл 5 н. NaOH. Меркаптоянтарную кислоту используют в виде раствора

150,1 мг этой кислоты в 3,5 мл глицинового буфера, причем рН доводят до

10,5 с помощью 700 мкл 5 í. NaOH.

Результаты: каждый образец перемешивают в течение ночи при 6 С и подвергают ЖХВД-анализу.

13277

Р -Меркаптопропионовая кислота приводит к приемлемым выходам инсулина, а меркаптоянтарная кислота дает очень плохие выходы. Оптимальное значение для МПК БН/SSO =1,40 и оно выше, чем в предыдущих исследованиях с этими цепями (выход инсулина 163).

Выводы: j3 -меркаптопропионовая кислота приемлемо эффективна в реакции соединения цепей А+В, а меркаптоян- 10 .тарная кислота как агент декарбоксилированного тиола весьма плоха.

Меркаптоуксусная кислота и ортомеркаптобензойная кислота.

Цель: определить, можно ли использовать меркаптоуксусную кислоту (МУК) или орто-меркаптобензойную кислоту (МБК) в качестве восстанавливающего тиол реагента в реакции сОединения цепей А+В.

Методика: свиную A (БЯО )„ и Е.coli В (880 ) используют для получения смешанного A/Â раствора с концентрацией 10 мг/мл в глициновом буфере с 25 рН 10,5. Для каждого образца используют по 1,4 мл этого смешанного А/В раствора.

Меркаптоуксусную кислоту используют в виде раствора 71 мкл этой кисло- Зр ты в 3,9 мл глицинового буфера, причем рН доводят до 10,5 с помощью

300 мкл 5 H. NaOH. Орто-меркаптобензойную кислоту используют в виде раствора 154,2 мг этой кислоты в

3,8 мл глицинового буфера, причем рН доводят до 10,5 с помощью 400 мкл

5 н. NaOH.

Результаты: каждый образец перемешивают в течение ночи и подвергают рр

ЖХВД-анализу. Затем выход инсулина рассчитывают.

Меркаптоуксусная кислота по сравнению с ДТТ и цистеином приводит к хорошим выходам инсулина, хотя в дан- 45 ном случае оптимум соотношения SH/SSO очень широк (1,2-2,0, выход 19,720,5 ). Выходы с использованием орто-меркаптобензойной кислоты существенно ниже (до 8,6X).

5Р

Вывод: в реакции соединения А+В меркаптоуксусная кислота весьма эффективна, а орто-меркаптобензойная кислота значительно менее эффективна.

Реакция соединения А+В с меркапто- 55 этанолом .или цистамином.

Цель: определить, можно ли использовать в реакции соединения цепей

А+В J3 — ìåðêàïòîýòàíîë или цистамин

90 12 (меркаптоэтиламин) в качестве восстанавливающего тиол агента.

Методика: свиную А (SSO ) и В (SS03) из Е.соli используют для получения. смешанного раствора А/В с концентрацией 10 мг/мл в глициновом буфере с рН 10,5. Для каждого образца используют по 1,4 мл этого смешанного раствора A/В.

Я -Меркаптоэтанол используют в виде, раствора его 70 мкл в 4,0 глицинового буфера, причем рН доводят до 10,5 с помощью 200 мкл 5 н. МаСН.

Результаты: кажцый образец перемешивают в течение ночи при 6 С и подвергают ЖХВД-анализу. Выход инсулина рассчитывают. Оптимум соотношения

SH/SSO 1, 25 как для -МЭ, так и для меркаптоэтила::ина, и совпадает с оптимумом для ДТТ и цистеи- на, однако максимальные выходы инсулина (8-9Z) существенно ниже.

Вывод: меркаптоэтанол и цистамин не эффективны в реакции соединения цепей А+В.

Реакция соединения А+В: цистеин по сравнению с ДТТ.

Цель: сравнение цистеина и ДТТ в реакции соединения А+В по эффективности соединения цепей А и B.

Методика: растворы цепей А, В и объединенный раствор А/В получают в глициновом буфере (0,1М) с рН 10,5.

Различие количе.ства растворов цистеина или ДТТ прибавляют к 1 4 мл аликвотам объединенного раствора А/В и перемешивают в 3-миллилитровых открытых ампулах в течение ночи при 6 С.

Результаты: были проведены расчеты выхода, ЖХВД-анализ и расчеты

SH/SSO . Максимальный выход инсулина в реакции соединения А+В составляет

947 от максимального выхода, получаемого с ДТТ. Однако пик зависимости от SH/SSO для цистеина более широк (1,0-1,5) чем для ДТТ, (1,2-1,3) и это определяет преимущество способа получения.

Выводы: цистеин приводит только к 90-95Х от максимального выхода, однако дает более широкий пик зависимости от SH/SSO по сравнению с ДТТ в реакции соединения цепей А+В.

- Температурное исследование: реакция соединения А+В.

Цель: изучение зависимости скорости реакции и выхода инсулина при соединении цепей А+В человеческого инсу13

1327790 лина от температуры проведения реакции.

Методика: 149 мг А (ББО ) из свиньи и 70 мг В (SSO ) из Е.coli

trp E растворяют соответственно в

14,9 и 7,0 мл 0,1 М глицинового буфера и доводят до рН 10,5 с помощью

5 н. NaOH. Получают ДТТ в концентрации 61,7 мг в 4,0 мл буфера и доводят до рН 10,5 с помощью 140 мкл

5 н. NaOH.

Образцы трех реакций соединения получак1т при различных температурах в ампулах емкостью 15 мл так, как указано ниже. Все растворы охлаждают до -1 С. В этой серии экспериментов

А/В=2,0, à SH/SÁÎ = 1,11.

Через различные промежутки времени эти образцы после разбавления 1:2 уксусной кислотой проверяют на содержание человеческого инсулина с помощью ЖХВД-8/25 анализ. Количественная оценка основана на УФ -анализе свиного инсулина при 15,5 мм /мкг, R=0,2.

Результаты: через 1 сут. образцы снова оценивают для определения конечного выхода инсулина.

Анализ полученных результатов показывает, что при комнатной температуре реакция соединения начинает протекать очень быстро, но в течение короткого промежутка времени (3 ч), образование инсулина прекращается при низком выходе инсулина (9,8Z), максимум достигается за 3-5 ч, содержание инсулина медленно падает (через 22 ч выход 4,87). При 6 С реакция образования инсулина протекает несколько быстрее, чем при 0 С до времени проведения реакции, равного

6 ч, однако конечные выходы при времени проведения реакции 23 ч практически одинаковы (соответственно 24,4 и 24,7X). За исключением проведения реакции при комнатной температуре не было обнаружено разложения инсулина эа счет разрыва дисульфидных связей вплоть до времени проведения реакции, равного 24 ч.

Исходя иэ реакционных зависимостей в табл. 2, приведены для каждой реакций соединения <

Таблица 2

Максимальный выход инсулина, 7

Образец Т, С

24,7

171

24,4

10 2

126

9,8

Зависимость t<, от темпера

Следовательно, температура обратно пропорциональна 4/2ммкс » однако непосредственно не связана с конечным выходом инсулина.

Выводы: проведение взаимодействия соединений А+В при 0 С по сравнению с проведением процесса в холодной

25 комнате (6 С) несколько замедляет реакцию, однако приводит к тому же самому конечному выходу инсулина (2425X). Проведение реакции соединения при комнатной температуре приводит к

30 снижению выхода. Реакцию соединения цепей А+В оптимально следует проводить при 0-6 С в течение 24 ч.

Осуществление предлагаемого способа позволяет повысить выход до 257 с 1-2Х и упростить процесс за счет проведения процесса взаимодействия

S-сульфонатов А- и В-цепей инсулина в одном аппарате в однофазном раство4О рителе.

Формула изобретения

Способ получения человеческого ин45 сулина или его аналогов путем взаимодействия S-сульфоната А-цепи человеческого инсулина или его аналога с

S-сульфонатом В-цепи человеческого инсулина, или его аналога в водной среде в присутствии тиолового восстанавливающего агента и кислорода воздуха, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода целевого продукта, процесс проводят в присутствии тиолового восстанавливающего агента, выбранного из группы, состоящей из дитиотриетола, дитиоэритрола, меркаптоуксусной кислоты, -меркаптопропионо1327790 16 воре 5-10 мг/мл, массовом соотнойе нии A-цепи и В-цепи 1:i 5-2:i при рН 9-11,5, температуре 0-22 С в течение 0,5 24 ч.

15 вой кислоты или цистеина, взятого в количестве 8-15 мас.Ж от общего количества S-сульфонатов А-цепи и В-цепи при обЩей концентрации белка в растСоставитель В. Волкова

Редактор Н. Киштулинец Техред Л.Олийнык . Корректор А. Ильин

Заказ 3398/58 Тираж 347

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4