Способ спектрометрического определения амидазной активности ферментов и детектируемая группа для его осуществления
Изобретение относится к области биоорганической химии, в частности к способам анализа ферментов, гидролизующих амидные связи. Изобретение может быть использовано в пищевой, фото-, микробиологической промьппленности, медицине и сельском хозяйстве. Целью изобретения является ускорение и упрощение процесса. Для определения амидазной ферментативной активности с помощью 1-(аминоацил)аминонафталин-5-сульфокислот последние вводят в реакционную смесь, содержащую буферный раствор, оптимальней для исследуемого фермента, другие компоненты , необходимые для проявления ферментативной активности (меркаптоэтанол, комплексоны, неорганические ионы и др.), смесь термостатируют, добавляют фермент и измеряют изменение оптической плотности либо в области поглощения продукта ( нм), либо в области поглощения субстрата ч ( нм) . Первое предпочтительно, так как другие соединения, обычно находящиеся в смеси, в этой области не поглощают. 1-(аминоацш1)аминонафталин-5-сульфокислота (АА) под действием фермента отщепляет 1-аминонафталин-5-сульфокислоту (АНСК): RTS1H 2 (О1О) ROH+ За ходом реакции наблюдают в УФ по убыли поглощения АА (280 нм) или приросту АНСК (330 нм). Е-трипсин, тромбин , папаин, проназа К-лейцил,тозилглицилпролиларгинил, карбобензоксиаргинило 2 с, и 3 з.п. ф-лы, 2 табЛо с (Л
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ag> SU an 1
А1
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н А BTOPCKOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4068115/31-13 (22) 29. 12. 84 (46) 15.12.87, Бюл, Р 46 (71) Институт молекулярной генетики
АН СССР (72) А.А.Недоспасов, В.Н.Незавибатько и H.Â.Êóçíåöîâ (53) 547.655.4(088.8) (56) Е.Chambers, G,W.Watt. J.Org.
Chem., 1941, 6, 376-383. (54) СПОСОБ СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ И ДЕТЕКТИРУЕИАЯ ГРУППА ДЛЯ ЕГО
ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ (57) Изобретение относится к области биоорганической химии, в частности к способам анализа ферментов, гидролизующих амидные связи. Изобретение может быть использовано в пищевой, фото-, микробиологической промьппленности, медицине и сельском хозяйстве.
Целью изобретения является ускорение и упрощение процесса. Для определения амидазной ферментативной активности с помощью 1-(аминоацил)аминонафталин-5-сульфокислот последние вводят в реакционную смесь, содержащую буферный раствор, оптимальнь|й для исследуемого фермента, другие компо(Ю 4 С 01 Л 3/40, С 07 C 143/60 ненты, необходимые для проявления ферментативной активности (меркаптоэтанол, комплексоны, неорганические ионы и др.), смесь термостатируют, добавляют фермент и измеряют изменение оптической плотности либо в области поглощения продукта (330 нм), либо в области поглощения субстрата (-280 нм) . Первое предпочтительно, так как другие соединения, обычно находящиеся в смеси, в этой области не поглощают, 1-(аминоацил)аминонафталин-5-сульфокислота (АА) под действием фермента отщепляет 1-аминонафталин-5-сульфокислоту (АНСК):
ВЪН Н21 о о ">0 ион+
3а ходом реакции наблюдают в УФ по убыли поглощения AA (280 нм) или приросту АНСК (330 нм). E-трипсин, тромбин, папаин, пронаэа, R-лейцил,тозилглицилпролиларгинил, карбобенэо ксиаргинил. 2 с. и 3 э.п. ф-лы, 2 табл.
В результате отказа от использования канцерогенных веществ — производных нафтиламина, обеспечивается возможность производства субстратов для ферментного анализа промьппленностью
СССР (расширение возможностей производства), отпадает необходимость ввоза субстратов из-за рубежа, улучшают1
Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к способам анализа ферментов, гидролизующих амидные связи.
Изобретение может быть использо вано в пищевой, фото, микробиологи-ческой промышленности, медицине и сельском хозяйстве.
Целью изобретения является ускоре- 10 ние и упрощение процесса °
Способ заключается в следующем. .Для определения амидазной ферментативной активности с помощью 1-(ами-. ноацил)аминонафталин-5 сульфокислот 15 последние вводят в реакционную смесь, содержащую буферный раствор, оптимальный для исследуемого фермента, другие компоненты, необходимые для проявления ферментативной активности 2р (меркаптоэтанол, комплексоны,. неорганические ионы и др,), смесь термостатируют, добавляют фермент и измеряют изменение оптической плотности либо в области поглощения продукта 25 (330 нм), .;ибо в области поглощения субстрата (-280 нм) . Первое предпочтительно, так как другие соединения, обычно находящиеся в смеси, в этой области не поглощают. 30
Пример 1. Определение активности трипсина по разложению i-(N—
М карбобензоксиаргинил)аминонафталин-5сульфокислоты.
2 мл реакционный смеси, содержащей 5 ° 10 M 1 И -карбобензоксиарги6 М, нил)-аминонафталин-5-сульфокислоты в 0,05 M трис-НС1-буфере рН 8,2, помещают в кювету спектрофотометра, термостатируют при 25 или 37, добав- 40 о ляют 50 мкм исследуемого фермента и в режиме повторного сканирования записывают спектр в области 400 240 нм.
Величину ферментативной активности определяют по приросту поглощения в 46 области 330 нм или по убыли поглощения в области 280 нм. Абсолютные величины определяют по молярной экстинкции 1-аминонафталин-5-сульфокислоты, относительные — по калибровоч- 80 ной кривой, построенной по стандартному раствору фермента.
Пример 2, 2 мп реакционной смеси, содержащей 1 10 М бромгидрата, лейциламинонафталин-5-сульфокислоты в 0,05 M трис-НС1-буфере рН 7,6, термостатируют при 25 С, добавляют
10 мкл исследуемого препарата — "Проназы" (смесь протеиназ, используемая
3 2 в биохимических исследованиях), инкубируют 10 мин, добавляют 1 мл О, 1 M раствора NaOH, измеряют оптическую плотность при 330 нм относительного, раствора, в который фермент добавляют непосредственно перед измерением.
Результаты по примерам 3-6 приведены в табл. 1.
Ускорение и упрощение процесса достигается за счет исключения операций экстракции, центрифугирования в ,связи с тем, что используемая в качестве детектируемой группы 1-аминонафталин-5-сульфокислота растворима в водных растворах, и в отличие от
2-(аминоацил)-1-нафтиламинов, используемых по прототипу, не является канцерогенной и является легко доступной.
Преимущество предлагаемого способа перед прототипом приведено в табл. 2 и 3.
В качестве детектируемой группы предложена 1-аминонафталин-5-сульфокислота, не являющаяся канцерогенной, достаточно растворимая в водных растворах, особенно при pH)6, т.е. в области максимальной активности многих протеаз, в том числе протеаз крови, а в качестве субстратов для определения активности ферментов соответственно используют 1 †(аминоацил)аминонафталин-5-сульфокислоты (или их соли). Дополнительными преимуществами
1-аминонафталин-5-сульфокислоты в качестве хромофорной группы ферментных субстратов являются интенсивная флюоресценция, что позволяет контролировать ход йроцесса на всех стадиях синтеза; наличие БОз Н-группы, увеличивающей растворимость в водных растворах; способность к азосочетанию как в виде азо-, так и после предварительного диазотирования, диазокомпонент с образованием интенсивно окрашенных красителей и; доступность (1-аминонафталин-5-сульфокислота применяется в качестве исходного соединения при синтезе красителей, выпуск ее освоен промышленностью и проводится в значительных масштабах).
1359253
4. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что продукт реакции л
20 определяют спектрофотометрически при 9 =330 нм и рН>6 в том же растворе, где проводилась ферментативная реакция.
5. Применение 1-аминонафталин-5сульфокислоты в качестве детектируемой группы субстратов ферментов, обладающих амидазной активностью, BNH
Таблица1
Буферный раст вор
Субстрат
Время инкубации) мин
Пример Фермент
1-Т озилглицил-1-пролил-1аргинил)аминонафталин-5сульфокислота
Трипсин
По примеру 1 10
То же
Тромбин
Папани
То же
I(1-(1-N -карбобензоксиаргинил)аминонафталин-5сульфокислота
0,05 М трисНС1 рН 8,0;
ЭДТА 0,001; дитиотреит
0,001
По примеру 1
25
Тромбин То же
31 ся условия труда персонала. В результате увеличения растворимости повышается максимально допустимая концентрация в пробе, что позволяет анализировать ферменты с низким сродством к субстрату (расширение области исследования), а также обеспечивает возможность анализа ферментов при низких температурах.
Формула изобретения
1. Способ спектрометрического определения амидазной активности ферментов, предусматривающий проведение ферментативной реакции гидролиза аминоацильного производного соединения нафталинового ряда с регистрацией изменения поглощения света, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью ускорения и упрощения процесса, в ка честве субстрата фермента используют
1-(аминоацил) аминонафталин-5-сульфо кислоты общей формулы: где R — - остаток аминокислоты, ациламинокислоты или пептида, или их соли, 5
2, Способ поп. 1, отличаюшийся тем что в качестве субУ страта используют 1-(N -карбобензоксиаргинил)аминонафталин-5-сульфокислоту или ее соль.
3. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве субстрата используют 1(тозилглицил-115 пролил-1-аргинил)аминонафталин-5сульфокислоту или ее соль.
1359253
Т а б л и ц а 2
Показатель
Прототип Предлагаемый
2-30 мин
Время инкубации
2 ч
Диазоль
Есть
Нет
Стадия экстракции этилацетатом
Есть
Нет Нет
Есть
Таблица3
Показатель
По прототипу Детектируемая группа
Есть
Нет
Есть
Нет
Составитель Л, Борисова
Редактор Н.Горват Техред M.Õoäàíè÷ Корректор А.Обручар й
Заказ 6109/23 Тираж 776 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035i Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-полиграфическое предприятие, г,ужгород, ул.Проектная, 4
Стадия центрифугирования
Операции переноса
Канцерогенность
Доступность
Способность образовывать водорастворимый краситель в реакции азосочетания
Производство Производится в СССР за- в СССР прещено
