Способ определения фосфорорганических нестицидов в воде

 

Изобретение относится к методам биологического анализа вод Целью изобретения является повьшение чувствительности и расширение функциональных возможностей за счет определения метаболитов фосфорорганических пестицидов Анализируемую пробу воды или забуферивают 0,1-М фосфатным буфером и фильтруют (при высоких концентрациях пестицидов) или токсикант, экстрагируют из воды хлороформом, хлороформ испаряют, экстракт растворяют в 0,1 М фосфатном буфере (при низких концентрациях пестицидов), в подготовленную пробу вносят фермент, наиболее чувствительный к определяемому токсиканту (ацетилхолинэстераза эритроцитов человека, холинэстераза. крови человека, пропионилхолинэстераза, холинэстераза сыворотки крови синца или плотвы, холинэстераза гомогената дафнии), пробы дважды инкубируют при определяют остаточную активность фермента и по калибровочным графикам, выражающим зависимость между концентрацией пестицида и угнетением активности фермента линейной функцией, рассчитывают содержание токсиканта в анализируемой пробе. 2 ЗоП. ф-лы, 1 табл. ю W Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

О9) Ы3 (Ill (51) 4 G 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

К ABT0PCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3987188/31-13 (22) 02.12.85 (46) 15.12.87. Бюл. У 46 (71) Институт биологии внутренних вод AH СССР (72) В.И.Козловская, Г.М.Чуйко, О.В.Мензикова и В.А,Петухова (53) 632.95 (088,8) (56) Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. Колос, 1983, с. 57-62.

Аугустинссон К.Б,Распределение и определение холинэстераз в организме млекопитающих. Бюллетень ВОЗ, 1972, т. 44, Р 1-2-3, с. 104-114, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ ПЕСТИЦИДОВ B ВОДЕ (57) Изобретение относится к методам биологического анализа вод. Целью изобретения является повышение чувствительности и расширение функциональных возможностей за счет определения метаболитов фосфорорганических пестицидов . Анализируемую пробу водь1 или забуферивают 0,1 М фосфатным буфером и фильтруют (при высоких концентрациях пестицидов) или токсикант экстрагируют из воды хлороформом, хлороформ испаряют, экстракт растворяют в 0,1 М фосфатном буфере (при .низких концентрациях пестицидов), в подготовленную пробу вносят фермент, наиболее чувствительный к определяемому токсиканту (аце тилхолинэ стер аз а эритроцитов человека, холинэстераза, крови человека, пропионилхолинэстераза, холинэстераза сыворотки крови синца или плотвы, холинэстераза гомогената дафнии), пробы дважды инкубируют при 30 С. определяют остаточную активность фермента и по калибровочным графикам, выражающим зависимость между концентрацией пестицида и угнетением активности фермента линейной функцией, рассчитывают содержание токсиканта в анализируемой пробе. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1 13597

Изобретение относится к способам

-биологического анализа качества воды, а именно к анализу природных и сточных вод на содержание в них фосфорорганических пестицидов и их биологически активных метаболитов по ацетилхолинэстеразной активности, и может быть использовано также в токсикологических исследованиях для 10 контроля стабильности исследуемых растворов и B скрининге (первичной проверке токсичности) вновь синтезированных химических соединений.

Целью изобретения является повыше- 15 ние чувствительности и расширение функциональных возмо ностей за счет определения метаболитов фосфорооргаческих пестицидов.

Дпя этого анализируемую пробу 20 воды или забуферивают 0,1 М фосфатным буфером рН 7,5 и фильтруют (при определении высоких концентраций пестицидов в случае гибели в водоеме рыбы и в лабораторных токсикопогических опытах) или подвергают дважды экстрагированию хлороформом (при определении низких концентраций, фоновые уровни загрязнения), затем хлороформ выпаривают, а экстракт раст-30 воряют в 0,1 M фосфатном буфере, Под-. готовленную первым или вторым способом пробу для анализа вносят в 3 пробирки по 2,5 мп в каждую, а в 3 другие пробирки вносят такое же количество 0,1 М фосфатного буфера (контроль). Затем во все пробирки добавляют по 0,5 мя раствора фермента — наиболее чувствительного к определяемому токсиканту, т.е, ингибируемого 40 более низкой концентрацией (таблица).

В таблице приведена концентрация пестицида (мг/л), снижающая активность фермента на 10-й предел определения Фосфорорганических пестицидов в воде энзиматическим способом, В 3-ю и 6-ю пробирки (пробирки сравнения, необходимые для определения степени окрашенности используемых растворов и исключения неферментативного гидролиза субстрата) кроме того вносят 2 капли 0,05Х-ного раствора прозерина для ингибирования фермента. Пробирки встряхивают и поме. 55 щают в водяную баню на 30 мин,чтобы обеспечить оптимальное взаимодействие фермента с токсикантом, и выдерживают там при 30 С, что ближе к

41

2 стандартным условиям протекания биохимических реакций. После инкубации в каждую пробирку приливают. 0,5 мл смеси 0,001 M ДТНБ (5,5-дитио-бис(2-нитробензойная кислота) и 0,00б М субстрата (при использовании фермента ацетилхолинэстеразы — ацетилтиохолинЙодид или ацетилтиохолинбромид„ пропионилхолинэстеразы — пропионилтиохолинйодид или пропионилтиахолинбромид, холинэстеразы — бутирилтиохолинйодид или бутирилтиохолинбромид) в соотношении 1:l. Смесь добавляют для образования окрашенного комплекса, появляющегося при взаимодействии субстрата с ферментом. Затем инкубируют повторно 10 мин, чтобы фермент провзаимодействовал с субстратом, и добавляют в 1,2,4,5-ю пробирки по

2 капли 0,05Х-ного раствора прозерина для остановки реакции, и определяют активность фермента методом

Эллмана, .в основе которого лежит измерение продукта реакции, а не непрореагировавшей части субстрата, как в методе Хестрина, что и обеспечивает более высокую точность предлагаемого способа, Степень окрашивания растворов в пробирках 1 и 2 измеряют относительно пробирки 3, в пробирках

4 и 5 относительно пробирки 6 пробирки на ФЭКе с зеленым светофильтром.

Высчитывают среднее значение исследуемых (l-ой и 2-ой пробирок) и конт- рольных (4-ой и 5-ой пробирок) проб и по формуле определяют степень угнетения активности фермента

Е 100

А = 100 — - — ——

Э к где А - степень угнетения активности фермента;

E — экстинкция исследуемой проon быj

E — экстинкция контрольной пробы, Процент угнетения активности фер-, мента переводят в пробит по таблице известным способом. Далее рассчитывают содержание в пробе пестицида по калибровочному графику. В отличие от прототипа на графике по оси ординат откладывают не проценты угнетения активности фермента, а пробиты процентов, а по оси абсцисс - не концентрации токсиканта, а логарифмы концентраций, что позволяет представить зависимость между концентрацияз 13597 ми токсиканта и угнетением активности фермента линейной функцией, При расчете. количества пестицида в исследуемой пробе по пробиту процента угнетения активности фермента находят

5 логарифм концентрации пестицида, а по таблицам антилогарифмов — концентрацию пестицида в мкг/л или мг/л исследуемой воды, 10

Пример, 1 л воды, отобранной в канале ирригационной системы на территории совхоза „проводящего обработку садов фозалоном, наливают в емкость, добавляют 25 мп хлороформа, пробу перемешивают 10 мин в руках или 5 мин на магнитной мешалке, затем переносят в делительную воронку. После отстаивания хлороформную фракI цию сливают в сосуд для выпаривания через воронку с фильтровальной бумагой и слоем безводного сернокислого натрия. Операцию экстракции повторяют дважды. Экстракт досуха выпаривают на водяной бане при 70 С или в колбе ро- 25 тационного испарителя типа ЭРА-СМ и:, растворяют в 10 мп фосфатного буфера.

В три пробирки вносят по 2„5 мл исследуемой пробы и в три пробирки по

2,5 мп 0,1 И фосфатного буфера (конт- 30 роль), Во все пробирки добавляют по

0,5 мл раствора холинэстеразы сыворотки крови человека, разведенной

0,1 М фосфатным буфером до активности по прибору 0,650, что соответству- З

35 ет 0,92 мкмоль/ч гидролизуемого субстрата или 0,015 Е, за 10 мин инкуба" ции, а в 3-ю и 6-ю пробирки кроме того по 2 капли 0,05%-ного раствора прозерина. Пробирки встряхивают.и 40 помещают на 30 мин в водяную баню с температурой 30"С. После инкубации в каждую пробирку вносят 0,5 мп смеси 0,001 М ДТНБ и 0,006 М субстрата . (бутирилтиохолинбромид или бутирил- 45 тиохолинйодид) в соотношении 1:1 °

Пробирки встряхивают и снова инкубируют в водяной бане при 30 С. После

10-минутной инкубации в пробирки

1,2,4,5 добавляют по 2 капли 0,05%ного раствора прозерина и затем измеряют степень окрашенности растворов в 1-ой и 2-ой пробирках относительно 3-ей пробирки и в пробирках

4 и 5 относительно пробирки 6 на ФЭКе с зеленым светофильтром, Результаты по пробиркам следующие:

1 0,220

2 0,236 «

41

4 0,647

5 0,653

Складывают результаты измерений пробирок 1 и 2, пробирок 4 и 5, высчитывают среднее значение и по формуле определяют степень угнетения активности фермента в %

Е аа

А = 100 — --аа- ——

Ек где Е „— экстинкция исследуемой пробы (О, 220+0, 236): "=О, 228;

Е к — экстинкция контрольной пробы (0,647+0,653}: 2=0,650

А — степень угнетения активности фермента равна 65%.

Процент угнетения активности фермента переводят В пробит — 65% соответствует, пробит 5,39, По предварительно построенному капиброво тому графику, используя пробит угнетен! я активности фермента, находят логарифм концентрации фозалона, рави!!й 2,4, а по таблицам антилогарифмов — концентрацию пестицида в анализируемой воде, которая составляет 0,004 мг/л.

Приведенный пример осуществления способа используется, рн проведении фоновых наблюдений за Водой, т ° е ° тОгда кОгда В Воде пр!!с! Тству ют малые концентрации пестицидов,, При наличии больших концентраци,, пестицидов в воде используется упрощенный вари-нт способа.

Пример, Берут 100 мп анапизируемой воды, забуферивают до рН

7,5, добавляя 1,22 г Na НРО+!! 0,193 г

NaH P0<, р Н контролируют р Н-метром или иономером. Пробу фильтруют через воронку с фильтровальной бумагой. В три пробирки Вносят по 2,5 мп подготовленной пробы и в три пробирки по 2,5 мп 0,1 М фосфатно"a буфера.

Во все пробирки добавляют по 0,5 мп сыворотки крови синца, разведенной

0,1 М фосфатным буфером 1:20 до активности по прибору 0,650, а в 3-ю и 6-ю пробирки кром того по две капли 0,05%-ного раствора прозерина.

Пробирки встряхивают и помещают на

30 мин в водяную баню с температуа, рой 30 С. После инкубации в каждую пробирку вносят 0,5 мл смеси 0,001 М

ДТНБ и 0,006 M субстрата бутирилтиохолинбромид или бутирилтиохолинйодид в соотношении 1: 1, Пробирки встряхи вают и снова инкубируют в Водяной ба20

Eon 100

А = 1ОО- — — — -, Ек

А = 100 — @ -"-100

Е

ЗО

45

50 пробиркам следуюпще:

О, 720

О, 740

0,060

0 064

Результаты по

2

5 13597 не при 30 С, После 10 мин инкубации в пробирки 2,,4 и 5 добавляют по

2 капли 0,05%-ного раствора прозерина и затем измеряют степень окрашенности растворов в пробирках 1 и 2

5 относительно пробирки 3 и в пробирках 4 и 5 относительно пробирки 6 на

ФЭКе при зеленом сфетофильтре.

Результаты по пробиркам следующие: 10

1 0,440

2 0,456 . 3 0,620

5 0,624

Складывают результаты измерений пробирок 1 и 2, и пробирок 4 и 5, высчитывают среднее значение, и по формуле определяют степень угнетения активности фермента в % где Е,„ — экстинкцня исследуемой пробы {0,440+0,456):2

0 Э 4В9 экстинкция к нтр л ой пробы (0,620+0,624) :2=

О 6223

А — степень угнетения активности фермента равна 28%.

Процент угнетения активности фермента переводят в пробит - 28% соответствует пробнту 4,4. По предварительно построенному калибровочному графику, используя пробит угнетения активности Фермента, находят логарифм концентрации фосфамида равный

О, а по таблицам антилогарифмов— концентрацию пестицидов в анализируемой воде, которая равна 1 мг/л При определении метаболитов, например метаболитов хлорофоса, в токсикологическом опыте при изучении поведения водяного ослика в растворах хлорофоса берут в начале опыта 10 мл анализируемой воды, забуферивают до

pI 7,5, добавляя 0,122 r Иа НРО+ и

0,0193 г NaH PÎ4., pH контролируют рН-метром кли иойомером. Пробу фильтруют через воронку с фильтровал ной бумагой, В трн пробирки вносят по 2,5 мл 0,1 М фосфатного буфера, Во все пробирки добавляют по 0,5 мл сыворотки крови синца, разведенной

0,1 М фосфатным буфером 1:20, до активности по прибору 0,750„ à в 3-ю и 6-ю пробирки, кроме того по две капли 0,05%гного раствора прозерина.

Пробирки встряхивают и помещают на

41 6

30 мин в водяную баню с температурой

30 С, После 10 мин инкубации в пробирки 1,2,4 и 5 добавляют по 2 кап-. ли 0,05% — ного раствора прозерина и затем измеряют степень окрашенности растворов в пробирках 1 и 2 относительно пробирки 3 и в пробирках 4 и 5 относительно пробирки 6, Результаты по пробиркам следующие:

1 0,725

2 О, 735

4 0,240

5 0,252

Складывают результаты измерений пробирок 1 и 2, и пробирок 4 и 5, высчитывают среднее значение и по

Формуле определяют степень угнетения активности ферментов в %

1 где Š— зкстинкция исследуемой On пробы (0,725+0,735): 2 =

= 0,7303

E — экстинкция контрольной пробы (0,240+0,252).: 2

= 0,246;

А — степень угнетения активности Фермента равна 66%, Через 4 ч (согласно схемы токсикологического опыта) опять берут

10 мл анализируемой воды, добавляют

0,122 г На НРО и доводят рН пробы до

7,5 ИаН РО, рН контролируют рН-метром или иономером. Пробу фильтруют через воронку с фильтровальной бумагой,В три пробирки вносят по 2,5 мл подготовленной пробы и в три пробирки по 2,5 мл 0,1 M Фосфатного буфера.

Во все пробирки добавляют о 0,5 мл сыворотки крови синца, разведенной

0,1 М фосфатным буфером 1:20 до активности по прибору 0,750, а в третью и шестую пробирки, кроме того по две капли 0,05%-ного раствора прозеpHHB„ Пробирки встряхивают и помещают на 30 мин в водяную баню с температурой 30 С. После 10 мин инкубации измеряют степень окрашенности растворов в пробирках 1 и 2 относительно пробирки 3 и в пробирках 4 и 5 относительно пробирки 6.

7 13597

Складывают результаты измерений пробирок 1 и 2 и пробирок 4 и 5, высчитывают среднее значение, и по фор" муле определяют степень угнетения ак5 тивности фермента в %

Z«1ОО

А 100 — — -- ——

Ек где Е „— экстинкция исследуемой пробы (0,720+0,740): 2 =

= О,7ЗО;

Е - экстинкция контрольной. к пробы (0,060+0,064): 2 =

0,062; 15 — степень угнетения активности фермента равна 85%.

Увеличение антихолинэстеразной активности раствора хлорофоса с 66 до

85% свидетельствует о повышении его 20 токсичности за счет превращения хлорофоса в токсичные метаболиты.

Формула изобретения

1. Способ определения фосфороргани-25 ческих пестицидов в воде, включакпций

Хлорофос

Q,ОООО6

0,017

0,002

ДДВФ

0,00014 0,00000000001

0,0000003

Матафос без экстракции 0,01

0,05

Q,000025 о,оз

0,02

Карбофос без экстракции 1,86

0,025

0,46 0,69

0,3 при экстракции 0,02

0,0002

0,002

0,0025 0;006 без экстракции 0,045 0,141 без экстр акции О, 0045 О, О 12 отбор пробы, введение в нее холинэстеразы и субстрата, инкубирование с последующим колориметрированием отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и расширения функциональных возможностей за счет определения метаболитов фосфорорганических пестицидов, перед введением фермента пробу забуферивают до рН 7,5, в полученный раствор вводят холинэстеразу, после чего полученную смесь инкубируют, в качестве субстрата используют бутирилтиохолинбромид или бутирилтиохилиниодид, который вводят после инкубации пробы с холинэстеразой.

2, Способ по п,1, о т л и ч а юшийся тем, что перед забуфериванием пестициды экстрагируют хлороформом.

3. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что после забуферивания из исследуемой пробы удаляют образовавшийся осадок.

1359741

Продолжение таблицы

Фозалон

0,02

0,04

0,05

0,76 при экстракции 0,002

0,0003 0,0004

0,0005

0,0076

Фосфамид беэ экст" ракции 19,05

19,05 19,05

0,19 при экстракции 0,2

0,2 0,2 0,002

Составитель Н,Костюнина

Техред Л.Сердюкова, Корректор О.Кравцова

Редактор Т.Парфенова

Заказ 6151/48

Производственно-полиграфическое предприятие, г,ужгород, ул.Проектная,4 без экстракции 0,2

Тираж 776 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д.4/5