Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1. (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Cb

М

4ь

СФ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3757952/28-14 (22) 13.07.84 (46) 07.01.88. Бюл. У 1 (71) Всесоюзный научно-исследователь" ский институт генетики и селекции промьппленных микроорганизмов и Институт биоорганической химии им.Шемякина (72) В.Г.Дебабов, Ю,Д.Цыганков, А.Ю.Чистосердов, Е.Д.Свердлов, Л.С.Изотова, С.В.Костров, В.Э.Стеркин, В.П.Кузнецов, С.В.Беляев, Г.С.Монастырская, И.С.Саломатина, Г.М.Долганов, С.Г.Арсенян, С.А.Царев, Ю.И.Козлов, А.Я.Стронгин, В.И.Огарков и Ю.А.Овчинников (53) 615.45:615.7(088.8) (56) Shepard Н.M. et. al. J. DNA, 1982, 2, р. 125-131.

Palva I. et. а1. J. "Сеш", 1983, 22, р ° 229-235.

Заявка Великобритании У 2079291 А, кл. С 12 N 15/00, 1983. (51)4 А 61 К 45/02, С 12 N 15/00 // (С 12 N 15/00, С 12 R 1:38) (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА

АЛЬФА-2 путем глубинного культивирования штамма-продуцента содержащего плазмиду с встроенным в нее геном человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2 в питательной среде в условиях аэрации с последующим выделением и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода интерферона, в качестве продуцента используют штамм Pseudomonas speciee

VG-84, несущий плазмиду pVG3, и культивирование осуществляют в присутствии стрептомицинаи тетрациклина в качестве 50-150 мг и 30-50 мг на

1 л среды соответственно.

1 136

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается производства интерферона.

Цель изобретения — повышение выхода интерферона.

Для осуществления способа используют штамм Pseudomonas speciee VG-84, несущий плазмиду pVG3, депонированный в Центральном Музее промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика" под номерои ЦМПМ В-3076.

Плазмида pVG3 является молекулярным гибридом между многокопийной векторной плазмидой широкого круга хозяев рАУС34 и плазмидой pIFN-a(2-Р2, . содержащей репликон pBR322 и ген интерферона альфа — 2 и определяющей устойчивость клеток к тетрациклину и ампициллину. В плазмиде pIFN-с(2-Р2 ген интерферона альфа-2 находится под контролем регуляторных областей гена Э бактериофага 9 Х174. Векторная плазмида рАУС34 размером в 9,4 тысяч пар нуклеотидов относится к

Inc Р-4/Q группе несовместимости, детерминирует устойчивость клеток к стрептомицину. Плазмидную ДНК рАУС34 и pIFN- 2-Р2 обрабатывают рестриктазой Pst Х и лигированной смесью трансформируют компетентные клетки штамма Е. coli C600. Трансформанты отбирают на полноценной питательной среде, содержащей антибиотики — ампициллин (50 мкг/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и тетрациклин (25 мкг/

/мл). В клонах-трансформантах обнаружена плазмидная ДНК, названная

pVG3, которая по размеру и рестрикционной карте соответствует гибриду между плазмидами рАУС34 и pIFN- 2-Р2.

Плазмида pVG3 детерминирует устойчивость клеток к стрептомицину подобно рАУС34 и тетрациклину и ампициллину подобно pIFN 42-Р2. Размер плазмиды pVG3 — 14,8 тысяч пар нуклеотидов равен сумме размеров плазмид

pIFN-(2-Р2 — 5,4 тысяч пар нуклеитидов и рАУС34 — 9,4 тысяч пар нуклеотидов

В один из штаммов Е. соli С600, содержащий гибридную плазмиду pVG3, была введена коньюгативная плазмида широкого круга хозяев R 751. В серии коньюгативных скрещиваний плазмида

pVG3 была переведена в бактерии рода

Pseudomonas и другие грам-отрицатель. ные бактерии. Бактерии-трансконьюганты отбирают на селективной среде

4343 с указанными выше антибиотиками и проверяют на способность синтезировать интерферон.

Полученные культуры выращивают в условиях интенсивной аэрации и перео мешивания при 30 С на L-бульоне в течение 6-10 ч до достижения титра ,бактерий 2-5х10 клеток/мл. Бактерии

Ъ собирают центрифугированием, разрушают ультразвуком и определяют содержание интерферона в клеточных экстрактах радиоиммунологическим методом. Бало проверено 18 штаммов грам-отрицательных бактерий, относящихся к родам Eschenichia, salmonlla

Pseudomonas, Methy Lomonas, Ervinia, Rhizobicem. Большинство проверенных штаммов продуцировали активный интерферон. Неибольшей продуктивностью отличался штамм Pseudomonas sp. UG-84.

В указанных условиях этот штамм продуцирует 5х10 -1х10" МЕ интерферона на .1 л культуральной жидкости.

25 Культурально-морфологические признаки.

Морфология под микроскопом. I paMотрицательные подвижные палочки длиной 3-5 мкм.

30 - Морфология на разных средах.

Мясо-пептонный агар. Через 24 ч роста при. ?5-30 С образует колонии с неровным краем диаметром 3-4 мм, поверхность шероховатая, цвет светлозеленый.

Мясо-пептонный бульон. Рост по уколу умеренный, в основном на поверхности среды. Рост без аэрации слабый.

4О Минимальная среда M 9 с глюкозой.

На 2 сут роста образует колонии диаметром 2-3 мм серого цвета, колонии круглые, шероховатые.

Физиологические и биохимические

45 признаки. Растет при 25-35 С, оптимум

30 С, рН 7,0. Источники углерода: утилизирует глюкозу, арабинозу. Источники азота: хорошо усваивает аммоний, мочевину.

p H M e p. Штамм Pseudomonas

sp. VG-84 выращивают при 28 С в течение 12 ч на скошенной агаризованной среде следующего состава: триптон

10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, аденин 80 мл/л, глюкоза 10 г/л, стрептомицин 150 мг/л, тетрациклин 50 мг/л, вода дистиллированная — до 1 л, агар — агар 15 г/л (среда А). Выросшую на косяках биомассу используют

13643

Составитель А. Маныкин

Техред Л.Олийньп Корректор С. Черни Редактор Е. Папп

Заказ 6505/5 Тираж 655 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород,ул, Проектная, 4 для приготовления посевного материала. Для этого клетки переносят в колбы Эрленмейера объемом 750 мл со

100 мл среды А (без агара) и выращи5 вают на качалке в течение 6 ч при интенсивном перемешивании (240 оборотов/мин) и температуре 28 С. Оптическая плотность посевной культуры—

2 оптических единицы. 10

Ферментацию проводят в ферментере, оснащенном системами для регулирования температуры, рН, скорости перемешивания и аэрации, датчиком для измерения парциального давления раст- 15 воренного кислорода. Для этого посевную культуру вносят в количестве

5 . в ферментер с жидкой питательной средой А (без агара) и выращивают в течение 6 ч при 28- 0,5 С, рН 6,7-6,9, 20 при интенсивной аэрации и перемешивании. Режим аэрации и перемешивания подбирают таким, чтобы рост культуры не лимитировался концентрацией растворенного кислорода, для чего зна- 25 чение парциального давления кислорода поддерживают на уровне 5-10 от насыщения. Для стабилизации рН используют аммиачную воду.

Рост биомассы контролируют путем ЗО измерения оптической плотности культуральной жидкости, которую измеряют каждый час на ФЭК-60 при длине волны

520 нм в кювете в длиной оптического пути 0,5 см. Ферментацию прекращают при величине оптической плотности

5 оптических единиц.

После окончания ферментации концентрация интерферона составляет

1х10 ME на 1 л культуральной жид- 4О кости. Для определения концентрации интерферона используют твердофазную модификацию радиоиммунологического анализа с применением антиинтерфероновых кроличьих поликлональных анти43 4 тел и меченых йодом — 125 мышиных моноклональных антител, а также определяют антивирусную активность интерферона по его защитному эффекту от цитопатического действия вируса везикулярного стоматита на культурах диплоидных человеческих фибробластов.

В качестве референс-препаратов используют национальные интерфероны— стандарты MRC В 69/19 (Великобритания) и PS (СССР).

Клетки, собранные центрифугированием после проведения ферментации, исполЬзуют в качестве источника интерферона. Клетки суспендируют в

0,1 М трис-буфере рН 7,5 из расчета

1 г клеток на 5-10 мл буфера и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток отделяют центрифугированием при 3000 g и из супернатантной фракции (клеточного экстракта) выделяют гомогенный интерферон альфа-2 с использованием известных методов — отделения нуклеиновых кислот осаждением 0,5 -ным полиэтиленимином, фракционирования сульфатом аммония при 65 насыщения, адсорбционной хроматографии на стеклах с контрлируемым размером пор и иммуноаффинной хроматографией на иммобилизованных на Сефарозе 4В мьппиных антиинтерфероновых моноклональных антителах.

В результате очистки получен элект рофоретически гомогенный препарат интерферона альфа-2 с очисткой в

210 раз и выходом по активности 41, обладающий удельной активностью

4,0 10 МЕ/мг. По удельной активности, молекулярному весу (18,4 кД), аминокислотному составу и т.д. выделенный интерферон альфа-2 не отличается от природного человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2..