Способ определения розеткообразующих клеток в биологических жидкостях

 

Изобретение относится к медицине , точнее к клинической иммунологии, предназначено для оценки Т-, В-лимфоцитов у больных и здоровых. Цель изобретения - повышение точности и сокращение времени определения. Для этого из пробы крови выделяют клетки

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) (5D 4 G 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС ГВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3940279/28-14 (22) 01 ° 08.85 (46) 07.01.88. Бюл. № 1 (71) Институт иммунологии (72) К.А.Лебедев, И.Д, Понякина и О.М.Котова (53) 616.36(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР № 1090409, кл. G 01 N 33/4ф, 1984. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РОЗЕТКООБРАЗУЮЩИХ КЛЕТОК В БИОЛОГИЧЕСКИХ

ЖИДКОСТЯХ (57) Изобретение относится к медицине, точнее к клинической иммунологии, предназначено для оценки Т-, В-лимфоцитов у больных и здоровых, Цель изобретения — повышение точности и сокращение времени определения. Для этого из пробы крови выделяют клетки (лейкоциты) и в концентрации 6-10»

«10 кл/мл помещают в лунку планшеты, центрифугируют с равным количеством

1Х-ной суспензии эритроцитов барана или мыши, или пекарских дрожжей, затем добавляют 2Х-ный р-р глутарового альдегида. Надосадок удаляю . К осадку в лунках добавляют дистиллированную воду и осадок сразу ресуспензируют. Готовят мазки, окрашивают их и подсчитывают количество розеткообразующихся лимфоцитов и нейтрофилов.

Для постановки реакции М-розеткообразования к клеткам приливают 0,05 мл суспензии, содержащей 1Х эритроцитов мыши, 20Х эмбриональной телячьей сыворотки и 79Х среды 199. Для постановки реакции Д-фагоцитоза используют

1Х-ную суспенэию клеток пекарских о дрожжей, убитых нагреванием при 90 С, 1 з,п. ф-лы.

1364986

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано в клинической иммунологии для оценки Т-, В-лимфоцитов и нейтрофилов у больных и здоровых.

Целью изобретения является повьппение точности и сокращение времени определения.

П р е р 1. У больного забирают из локтевой вены 3 мл крови в центрифужную пробирку, содержащую 0,3 мл раствора гепарина концентрации 200 ед./

/мп. В пробирку добавляют 1 мл 37.-ного раствора желатина в физрастворе, 15 перемешивают, после чего отстаивают при 37 С в течение 25 мин. Верхний лейкоцитарный слой собирают (его объем 2 мл). В пробирку с вьщеленными таким образом лейкоцитами добавляют среду 199 до объема 10 мл, клетки осаждают центрифугированием при 400 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют.

К осадку добавляют 1 мл дистиллиро- 25 ванной воды, через 15 с добавляют среду 199 до объема 10 мл. Клетки осаждают центрифугированием, надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют, добавляют 0,8 мл среды

199.. Концентрация клеток в среде 0 6»

«10 кл/мл.

В три лунки планшета для иммунологических реакций помещают по 0,05 мл полученной суспензии клеток. После этого в одну лунку добавляют 0,06 мл

17-ной суспензии эритроцитов барана в среде 199, в другую — по 0,05 мл

17.-ной суспензии эритроцитов мьппи (содержащей 20Х эмбриональной телячь- 40 ей сыворотки), в третью лунку—

0 05 мл 17.-ной суспенэии клеток пекарских дрожжей, убитых нагреванием.

Планшет плотно закрывают крьппкой с резиновой прокладкой, центрифугируют 4В при 200 g в течение 5 мин, после чего инкубируют при 4 С 30 мин. Затем в каждую лунку осторожно добавляют по 0,05 мп 2Х-ного раствора глутарового альдегида. Через 5 мин надоса- Вп дочную жидкость стряхивают в раковину, и в каждую лунку добавляют по

0,1 мл дистиллированной воды. Осадок ресуспендируют при помощи автомати-. ческого встряхивателя, после чего го- ВВ товят мазки. Высушенные мазки фиксинуют в метаноле, окрашивают метиловым зеленым — пиронином и подсчитывают количество Е- и М-розеткообразующих лимфоцитов и нейтрофилов, Д-розеткообразующих лимфоцитов) и Д-фагоцитирующих нейтрофилов на 100 соответствующих клеток.

В результате анализа у данного больного оказались следующие данные, Х: Е-РОЛ 80; Е-РОН 17; М-POJI

22; M-POH 14; Д-РОЛ 14; Д-фагоцитоэа нейтрофилов 90 (РОЛ-розеткообразующие лимфоциты, POH-розеткообразующие нейтрофилы, Е-эритроциты барана, M —эритроциты мыши, Д вЂ” клетки пекарских дрожжей).

Пример 2. У донора забирают

0,3 мл крови из пальца при помощи туберкулинового шприца, смоченного раствором гепарина (концентрации 200 ед./

/мл). В пробирку, содержащую 0,3 мл крови, для лизиса эритроцитов приливают 9 мл дистиллированной воды, перемешивают в течение 30 с. Затем приливают 1 мл 10-кратного концентрата раствора Хенкса для восстановления осмотического давления, перемешивают, клетки осаждают центрифугированием при 200 g в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливают, к осадку приливают среду 199 до объема 0,3 мл. Полученную суспензию клеток (концент6 рация клеток 10 10 кл/мл) использовали для постановки реакции роэеткообразования и фагоцитоэа.

0,05 мл полученной суспензии клеток вносят в лунку планшета для иммунологических реакций, куда приливают также 0,025 мл 17-ной суспензии клеток пекарских дрожжей, убитых нагреванием, и 0,025 мл 1Х-ной суспензии эритроцитов барана. В другую лунку планшета вносят 0,05 мп суспензии полученных клеток, 0,025 мл

1Х-ной суспенэии клеток пекарских дрожжей, убитых нагреванием, и

0,025 мл 1Х-ной суспензии эритроцитов мьппи (содержащей 207 эмбриональной телячьей сыворотки). Центрифугируют при 200 g в течение 5 мин и ино кубируют при 4 С в течение,30 мин.

Затем в лунки осторожно добавляют

0,05 мл 207.-ного раствора глутарового альдегида, выдерживают в течение

5 мин, надосадочную жидкость стряхивают в раковину, затем в лунки добавляют по 0,1 мл дистиллированной воды.

Осадок ресуспендируют и готовят мазки. Высушенные мазки фиксируют в метаноле и окрашивают метиловым зеленым — пиронином. При этом лимфоциты

1364986

45 окрашивались в темно-фиолетовый цвст, нейтрофилы — в голубой, клетки пекарских дрожжей — в ярко-малиновый цвет, а эритроциты имели бледно-бежевую

5 окраску, что дает возможность одновременного подсчета не менее четырех показателей. В результате проведения реакции одновременно с клетками пе карских дрожжей и эритроцитами бара- 10 на определили следующие данные, 7:

E-РОЛ 68; Е-POH 32; Д-РОЛ 12; Д-фагоцитоза 85; двойные розетки ЕД-РОЛ 6.

Д-фагоцитирующие Е-розеткообразующие нейтрофилы 11. В результате проведе- 15 ния реакции одновременно с клетками пекарских дрожжей и эритроцитами мыши определили, 7: М-РОЛ 6; М-РОН 10;

Д-РОЛ 12; Д-фагоцитоз 82; двойные розетки МД-РОЛ 2; Д-фагоцитирующие 2р

M-роэеткообразующие нейтрофилы 3.

Пример 3. У больного получают смыв из зева путем ополаскивания горла 10 мл среды 199 (предварительно полость рта очищали для удаления 25 загрязнения). Клетки смыва из зева осаждают центрифугированием при 200 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют.

Добавляют среду 199 до объема 10 мл, 30 .клетки вновь осаждают центрифугированием в том же режиме, надосадочную жидкость сливают. Осадок гесуспендируют и добавляют к нему среду 199 до объема 0,2 мл. Концентрация клеток составила 8 1О кл/мл, С полученными

6 35 клетками ставили реакцию розеткообразования с эритроцитами барана, мыши и клетками пекарских дрожжей так, как описано в примере 1. В результате 40 анализа получили следующие данные, 7: уровень Е-POH 30; Е-PO эпителиальных клеток 81; М-POH 12; М-PO эпителиальных клеток 61; Д-POH 35; Д-фагоцитоз нейтрофилов S; Д-РО эпителиальных клеток 75.

Пример 4. У больного получают смыв из бронхов путем лаважа бронхиального дерева, который осуществляют во время фибробронхоскопии. Клетки

50 осаждают центрифугированием при 200 g в течение 10 мин.

Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют. Добавляют среду 199 до объема 10 мп, клетки вновь осаждают центрифугированием в том же режиме, надосадочную жидкость сливают. Осадок ресуспендируют и добавляют к нему 0,5 мл среды 199, концентрация клеток 7 10 кл./мл. С полученными клетками ставили реакцию Е-, 1- и Д-розеткообразования так, как описано в примере 1.

В результате анализа получили следующие данные, 7: Е-РОЛ 62; Е-POH 26;

М-РОЛ 12; М-POH 7; Д-РОЛ 12; Д-РОИ

42; Д-фагоцитоз нейтрофилов 18; F.-PO альвеолярных макрофагов 38; M-РО альвеолярных макрофагов 45; Д-фагоцитоз альвеолярных макрофагов 36.

Предлагаемый способ обладает более высокой точностью по сравнению с известным. Для определения точности способа ставили три параллельные пробы из одной крови и определяли максимальное различие показателей среди этих проб. Данные показывают, что различия результатов при постановке трех параллельных проб по предлагаемому способу были достоверно (PL0,05) и существенно (в 1,5-2,4 раза) ниже, чем по известному, что свидетельствует о более высокой точности предлагаемого способа.

Осуществление предлагаемого способа занимает значительно меньше времени, чем осуществление известного, так как исключаются операции раскапывания эмбриональной телячьей сыворотки, центрифугирования при отмывке от глутарового альдегида, все операции по подготовке и центрифугированию (уравновешивание и расстановка пробирок), существенно (не менее, чем в 2 раза) сокращаются операции по раскапыванию клеток, индикаторных частиц, глутарового альдегида и дистиллированной воды. В целом суммарное количество операций сокращается с 13 (известный) до 9 (предлагаемый способ). Поэтому для анализа 50 клеточных суспензий на Е-, М- и Д-розеткообразование требуется по предлагаемому способу 82 мин, в то время как по известному 150 мин, т.е. в 1,8 раз меньше. Для анализа 100 клеточных суспензий по предлагаемому способу требуется 100 мин, по известному

210 мин, т.е. меньше в 2,1 раза (нем больше количество анализов, тем больше экономия времени по предлагаемому способу).

Предлагаемый способ является более экономичным, чем известный, поскольку исключает использование пробирок (3 пробнрки на один анализ крови на Е- M- и Д-PO), штативов, требу1364986

Составитель П. Бонарц в

Редактор Н.Гунько Техред Л.Сердюкова Корректор И.Эрдейи

Заказ 6591/37 Тираж 847 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприя-ие, г.ужгород, ул.Проектная, 4 ет меньшего количества центрифуг, среды 199 (в два раза), дистиллированной воды (не менее, чем в 100 раэ).

Формула изобретения

1 . Способ определения розеткообраэующих клеток в биологических жидкостях, включающий выделение клеток, смешивание с индикаторными частицами, центрифугирование, инкубацию, обработку глутаровым альдегидом с последующим приготовлением мазков и подсчетом роэеткообразующих клеток, о т- 15 л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности и сокращения времени определения, исследуемые клетки в концентрации 6-10 млн кл,/мл вносят в лунки планшета, добавляют равный объем 1Х-ной суспенэии индикаторных частиц, герметично закрывают во время центрифугирования и инкубации, а обработку осадка клеток ведут равным объемом 27.-ного глутарового альдегида.

2„ Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве индикаторных частиц используют эритроциты мыши, или эритроциты барана, или клетки пекарских дрожжей.