Способ определения нелетучих биогенных аминов в пищевых продуктах

 

Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано для определения микроколичеств нежелательных токсикд,нтов в пищевых продуктах и биологических объектах . Цель изобретения заключается в повышении достоверности определения . Способ заключается в подщелачивании до рН от 9 до 14 растворов, содержащих биогенные амины и летучие амины. При Подщелачивании удаляются аммиак и летучие амины - мелиламин, диметиламин, этиламин, диэтиламин, пропиламин, изопропиламин, бутиламин, изобутиламин, пиперидин и др., а нелетучие биогенные амины остаются в остатке. 1 табл. С/)

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) (51)4С 01 N 33 48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

К ABTOPCKOMV СВИ4ЕТЕЛЬСТВУ (21) 4113035/28-13 (22) 04.06.86 (46) 07.01.88. Бюл. № (71) Институт питания АМН СССР (72) Я.Л.Костюковский и Д.Б.Меламед (53) 547.15(088.8) (56) Чудинов A,А., Чудинова Л,А,, Коробов В.П. Метод определения низкомолекулярных олигоаминов в различном биологическом материале. Вопросы медицинской химии, 1984, ¹ 4, с. 127-132.

Меламед Д.Б,, Костюковский Я.Л.

Актуальные проблемы гигиены питания.

М., Институт питания АМН СССР, 1984, с. 63-76. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕЛЕТУЧИХ

БИОГЕННЫХ АМИНОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ (57) Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано для определения микроколичеств нежелательных токсикантов в пищевых продуктах и биологических объектах. Цель изобретения заключается в повышении достоверности определения. Способ заключается в подщелачивании до рН от 9 до 14 растворов, содержащих биогенные амины и летучие амины. При подщелачивании удаляются аммиак и летучие амины — мелиламин, диметиламин, этиламин, диэтиламин, пропиламин, изопропиламин, бутиламин, изобутиламин, пиперидин и др., а нелетучие биогенные амины остаются в остатке. 1 табл. где K — коэффициент, учитывающий взятую для анализа аликвоту;

1,I, — интенсивности флуоресценции элюатов опытной и стандартной проб, отн.ед.; h| - объем нанесенного на хроматограмму элюата опытной пробы, мкл;

v — объем нанесенного на хроматограмму элюата стандартной пробы, мкл;

P — - количество определяемого амина в стандартной пробе, выбранной для сравнения,мг;

M — масса образца пищевого продукта (4г) или объем (л).

Пример 1. 10 мл модельного экстракта, представляющего собой раствср, содержащий 20 мг/л аммиака, по 10 мг/л метиламина, диметиламина, диэтиламина, пропиламина, изопропиламина, бутиламина и изобутиламина, а также по 0,5 мг/л путресцина, кадаверина, фенетиламина в 0,02 н. НС1, упаривают досуха. Осадок растворяют в 1 мл 50Х-ного метанола, добавляют

1 13649

Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано для определения микроколичеств нежелательных токсикантов в пищевых продуктах и биологических объектах.

Цель изобретения — повышение достоверности определения.

Способ заключается в той, что при подщелачивании упаренного экстракта удаляются аммиак и летучие амины— метиламин, диметиламин, этиламин, диэтиламин, пропиламин, изопропиламин, бутиламин, изобутиламин, пиперидин и другие, а нелетучие биогенные амины остаются в остатке. При дальнейшей обработке реагентами для получения производных, например дансилхлоридом, в пробе образуются только производные анализируемых биогенных аминов, которые легко разделяются и определяются с помощью ТСХ. В этом случае помехи, создаваемые наличием в пробе производных аммиака и летучих аминов, отсутствуют, что облегчает 25 расшифровку хроматограмм и существенно увеличивает достоверность определения по сравнению с известными методами.

Способ осуществляется следующим 30 образом.

Пробу пищевого продукта гомогениэируют с водным раствором кислоты, например 0,02 н. соляной, или со смесью водного раствора кислоты и ацетона, центрифугируют или фильтруют и аликвотную часть упаривают досуха. Остаток тщательно перемешивают с 50Х-ным метанолом или этанолом.

С помощью 0,01 н. спиртового раствора щелочи устанавливают рН пробы

9-14, преимущественно 9-11, и упаривают при 90-100 С досуха. При этом из экстракта удаляются аммиак и летучие амины. Содержащиеся в остатке нелетучие биогенные амины превращают в соответствующие производные, например дансиламиды. Для этого к остатку приливают дистиллированную воду и ацетоновый раствор дансилхлорида, выдерживают 14-16 ч при комнатной температуре или 1,5-2 ч при 50 С, затем добавляют воду и бензол, энергично встряхивают и отбирают органический слой. Параллельно готовят такие же производные из смеси химически чистых биогенных аминов, набор которых обусловлен предполагаемой номенклатурой биогенных аминов в ана87 2 лизируемом объекте. Например, по

20 мг гистамина, фенетиламина, путресцина, кадаверина растворяют в 100 мл

0,02 н. соляной кислоты. Аликвотные колич:ества стандартного раствора, например 20 и 100 мкл, превращают в те же производные, что и в опытной пробе °

После получения производных по 510 мкл бензольных растворов опытной и стандартных проб наносят на одну пластинку и хроматографируют.

Биогенные амины идентифицируют по флуоресценции в УФ-свете сравнением пятен в опытной и стандартных пробах. При этом визуально можно оценить содержание биогенных аминов. Для количественного определения соответствующие зоны элюируют одинаковым количеством бензола, центрифугируют или фильтруют и измеряют на флюориметр» интенсивность флуоресценции, используя в качестве пробы сравнения стандартную пробу, наиболее близкую к опытной по содержанию анализируемых веще тв.

Расчет концентрации (мг/кг или мг/л) биогенных аминов производят по формуле

С=К - >-, ?

987

3 1364

0,01 н. раствор КОН в 50Х вЂ” ном метаноле до рН 9 и упаривают при 100 С досуха. Остаток смешивают с 0,5 мл дистиллированной воды, добавляют

1,5 мп ацетонового раствора дансилхлорида (3 мг/мп). доводят рН до 10 и выдерживают 16 ч при комнатной температуре. Затем в пробу вводят 2 мл воды и 1 мл бенэола, тщательно пере- 10 мешивают и отбирают бензольный слой.

Аналогично дансилируют 20 и 100 мкл стандартной смеси, представляющие собой растворы (по 200 мкг/мп) нелетучих биогенных аминов (фенетиламина, 15 путресцина, кадаверина) в 0,01 н. НС1.

По 5 мкл опытной и обеих стандартных проб наносят на пластинку силуфола и хроматографируют в системе бензол — триэтиламин (5:1). При рас- 20 смотрении в УФ-свете (360 нм) полученной хроматограммы в опытной пробе обнаружены только имеющиеся в стандартной смеси дансилпроизводные биогенных аминов — путресцин, кадаверин 25 и фенетиламин (соответственно 0,44, 0 56 и 0,63).

Пятна дансилпроизводных летучих аминов и аммиака в опытной пробе отсутствуют. 30

Пятна с одинаковыми R в опытной и стандартной пробах элюируют по 1мл бенэола, фильтруют и измеряют интенсивность фпуоресценции при 360/490 нм.

Расчет, проведенный по формуле, показал, что в модельном экстракте содержится, мг/л: путресцин 0,48; кадаверин 0,49; фенетиламин 0,46.

Пример 2, 0,01 кг (10 г) измельченного швейцарского сыра гомо- 40 гениэируют с 60 мл смеси 0,02 н.НС1 и ацетона (3:1) и центрифугируют.

Жидкую фазу отделяют, отбирают 6 мл и упаривают досуха. Сухой остаток тщательно перемешивают с 0 5 мл

50Х-ного метанола, добавляют 0,01 н. раствор КОН в 50Х-ном метаноле до о рН 10 и упаривают при 90 С досуха.

К остатку добавляют 0,5 мл дистиллированной воды и 1,5 мл ацетонового раствора дансилхлорида концентрации

3 мг/мл, доводят рН до 9 и выдержио вают 2 ч при 50 С. Затем пробу охлаждают и вводят 2 мл дистиллированной воды и 1 мл бензола, тщательно перемешивают и отбирают органический слой. Параллельно в две пробирки, содержащие по 0,5 мп дистиллированной воды, вводят 20 и 100 мкл стандартного раствора гистамина, фенетиламина, путресцина и кадаварина в

0,02 н. НС1 (по 200 мкг/мл каждого) и дансилируют аналогично опытной пробе. На хроматографическую пластинку с силикагелем КСК наносят по 5 мкл обоих стандартов и 10 мкл опытной пробы и проявляют в системе хлороформ — триэтиламин — бенэол 15:3: 10.

Визуально в УФ-свете (360 нм) рассматривают пластинку. В опытной пробе наблюдаются пятна, имеющие R, равные

R гистамина, путресцина и кадаверина. Пятна с соответствующими R< в опытной и наиболее близкой по йнтенсивности стандартной пробах элюируют

1 мл бенэола и измеряют флуоресценцию (360, 490 нм) на спектрофлуориметре.

Расчет, проведенный по формуле, показал, что в швейцарском сыре содержатся, мк/кг: гистамин 10,7; путресцин 17,6; кадаверин 11,2.

Пример 3. 10 r (0,01 кг) трески свежемороженной гомогенизируют с 50 мл 0,02 н. НС1 и фильтруют. Отбирают 5 мл фильтрата и упаривают досуха. Сухой остаток тщательно перемешивают с 1 мп 50Х-ного этанола, подщелачивают 0,01 н. КОН до рН 11 и упаривают при 100 С досуха. К остатку добавляют 0 5 мл дистиллированной воды и 1,5 мл ацетонового раствора дансилхлорида концентрации 4 мг/ мл, доводят рН до 9,5 и оставляют на ночь (16 ч) при комнатной температуре. Затем к пробе добавляют 2 мл дистиллированной воды и 1 мл бензола, энергично встряхивают и отбирают органический слой. Параллельно в две пробирки, содержащие по 0,5 мл дистиллированной воды, вводят 30 и

150 мкл стандартного раствора химически чистых гистамина, путресцина, кадаверина, спермина и спермидина в 0,02 н. НС1 (по 200 мкг/мл каждого) ! и дансилируют аналогично опытной пробе и хроматографируют в системе хлороформ — триэтиламин — бензол

15:3: 10 °

Рассматривают пластинку в УФ-свете (360 нм). В опытной пробе наблюдаются пятна с R, равными R< пятен гистамина, путресцина, кадаверина и спермина, Пятна с одинаковыми К в опытной пробе и наиболее бизком по интенсивности стандарте злюируют

0,5 мп бенэола и измеряют интенсивУдалено амина, Х, при рН г

Летучие амины (Диметиламин 0

98, 1 100 100 100

Дибутиламин 0

85,8 100 100 100 р5

Составитель Л.Борисова

Редактор Н.Гунько Техред Л.Сердюкова Корректор H.Ýðäåéè

Заказ 6591/37 Тираж 847 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1 13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г,ужгород, ул.Проектная, 4

5 136 ность флуоресценции (360/490 нм) в опыте относительного стандарта.

Расчет по формуле показал, что в образце трески свежемороженной, содержатся, мг/кг: гистамин 7 4 путресцин 12,3; кадаверин 18,8; спермин 2,7.

Влияние рН на полноту удаления летучих аминов при упаривании растворов, содержащих различные амины концентрации 100 мг/мл, отражено в таблице.

Иэ приведенных в таблице данных видно, что подщелачивание раствора до рН выше 8 обеспечивает полное удаление летучих аминов. Введение избытка щелочи нецелесообразно, поэтому предпочтительнее доведение рН до 9-11.

Надежная идентификация и определение нелетучих биогенных аминов достигаются по предлагаемому способу при их содержании 10-30 нг в пятне. Спо4987 в соб проверен на различных видах пищевых продуктов.

Предлагаемый способ идентификации и определения нелетучих биогенных

5 аминов устраняет мешающее влияние на определение биогенных аминов аммиака и летучих аминов, содержащихся в экс» трактах иэ пищевых продуктов, сущест венно облегчает расшифровку хроматограмм и идентификацию биогенных аминов, повышает достоверность определения за счет уменьшения вероятности получения ложных результатов, Вследствие своей высокой чувствительности, простоты, быстроты и удоб ства выполнения способ может применяться как в научно-исследовательских учреждениях, так и в лабораториях гигиенического и биохимического профиля, например санэпидстанциях, для анализа биогенных аминов в пищевых продуктах и биологических объектах.

Формула изобретения

Способ определения нелетучих биогенных аминов в пищевых продуктах, ЗО предусматривающий экстракцию их из образца, удаление растворителя, хроматографическое разделение и количественное определение их, о т л и— ч а ю шийся тем, что,с целью повышения достоверности определения, 35 в полученном экстракте осуществляют отделение летучих аминов путем доведения рН экстракта до 9 — 14.