Способ получения средства, селективно тормозящего рост или размножение нормальных и лейкемических клеток миелоидов

 

Изобретение относится к биохимии . Цель изобретения - повышение активности целевого продукта. Кровь лошади обрабатывают гепарином. После отстаивания верхний слой отделяют и центрифугируют. Осадок, содержащий клеточную популяцию, суспендируют в фосфатном буфере и центрифугируют. Полученный осадок гранулоцитов суспендируют и гомогенизируют. Гомогенизат центрифугируют и отделенную жидкость подвергают ультрафильтрованию , отделяя фракцию с молярной массой менее 10000. Фильтрат лиофилизируют, растворяют в растворе кислого карбоната аммония и подвергают гельхроматографии. Осажденную фракцию отделяют и лиофилйзируют. Вещество, выделенное из гранулоцитов, тормозит размножение только миелоидных клеток. 2 табл. СО

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

09) (11) )) 4 А 61 К 35/14

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К IlATEHTY (56) Патент ВНР - 162446, кл. С 07 G 17/00, 1970.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3230703/28-14 (22) 14.01.81 (31) 68/80 (32) 15.01.80 (33) HU (46) 15.01.88. Бюл. Ф 2 (71) Рихтер Гедеон Ведьесети Дьяр PT (HU) (72) Андраш Балаж,Михай Шайго,Лайош Кишфалуди, Тибор Клуг.п и Миклош— не Барабаш (Н0) (53),615.45 (088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, СЕЛЕКТИВНО ТОРМОЗЯЩЕГО РОСТ ИЛИ РА3МНОЖЕНИЕ НОРМАЛЬНЫХ И ЛЕЙКЕМИЧЕСКИХ

КЛЕТОК МИЕЛОРЩОВ (57) Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения — повышение активности целевого продукта. Кровь лошади обрабатывают гепарином. После отстаивания верхний слой отделяют и центрифугируют. Осадок, содержащий клеточную популяцию, суспендируют в фосфатном буфере и центрифугируют.

Полученный осадок гранулоцитов суспендируют и гомогениэируют. Гомогенизат центрифугируют и отделенную жидкость подвергают ультрафильтрованию, отделяя фракцию с молярной массой менее 10000. Фильтрат лиофилизируют, растворяют в растворе кислого карбоната аммония и подвергают гельхроматографии. Осащцеииую фракцию от- Q) целают и лиофилмаируют. Вещество, выделенное из гранулоцитов, тормозит размножение только миелоидных клеток.

2 табл.

7837 2

1 136

Изобретение относится к медицине, в частности к способам получения эф фективных веществ из здоровых клеток крови.

Пелью изобретения является повышение активности целевого продукта.

Способ осуществляется следующим образом.

Здоровые белые кровяные тельца, полученные из крови животных или человека, предпочтительно из крови лошади, гомогенизируют в буферном растворе рН 7-8, жидкий гомогенизат центрифугируют, из жидкой части выделяют растворимые составные части с молекулярной массой менее 10000 с помощью молекулярного фильтрования и затем эту фракцию подвергают дальнейшему фракционированию путем гель-хроматографии. Выделяют фракцию, осаждаюшуюся между объемными значениями v /v, 1,15 и 1,45, и лиофилизируют.

Кроме того, способ может быть осуществлен следующим образом.

Органы животных, предпочтительно телячью селезенку, содержащие гранулоциты, гомогенизируют в смешивающемся с водой растворителе, предпочтительно в ацетоне. Из полученной жидкой сусйензии вьщеляют твердое вещество путем центрифугирования, экстрагируют растворяющим жир органическим растворителем, преимущественно хлорсодержащим углеводородом, твердый остаток экстрагируют водой (нерастворимую часть целесообразно отделять центрифугированием) и из полученной жидкой части вьщеляют растворенные составные части с молекулярной массой менее 10000 путем молекулярного фильтрования. Эту фракцию подвергают дальнейшему фракционированию, преимущественно путем гель-хроматографии. Отделяют фракцию, осаждающуюся между значениями v /v

1,3 и 2,5, и лиофилизируют последнюю.

Затем полученный по оцному из приведенных вариантов способа или продукт (фракция Gl-3) очищают хроматографическим методом или бумажным электрофорезом и вьщеляют положительно реагирующий на хлортолидин пептид (белок), показывающий отрицательный заряд при рН 6,5 и относительную подвижность между -0,55 и -0,65, считая на аспарагиновую кислоту, и отсутствие заряда при рН 1,9 и подвижность

0,26, считая на Е -ДНП-лизин, после чего лиофилизируют.

Пример 1. Получение фракции

G1-3 из крови лошади.

10 л крови лошади обрабатывают

3500 ед/л гепарина, затем для седиментации выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин. Верхний богатый лейкоцитами слой отделяют и центрифугируют при 800 g. Полученную в качестве осадка .содержащую 80Х гранулоцитов клеточную популяцию затем суспендируют в 200 мл 0,06 M фосфатного буферного раствора с рН 7,4 (состав: 9,500 г двуосновного кислого ортофосфата натрия, и 1,815 r двуосновного кислого ортофосфата калия в 1 л дистиллированной воды) и вновь центрифугируют при 800 g. Полученный осадок гранулоцитов суспендируют в таком же фосфатном буферном растворе

9 в концентрации 4 10 клеток/мл и гомогенизируют в гомогенизаторе Поттера при 10 об/мин.

Полученный гомогенизат центрифугируют при 1550 g и отделенную жидкость подвергают ультрафильтрованию через мембрану Амикон PM 10 под давлением 3 атм, отделяя фракцию с мо-: лярной массой менее 10000. Полученный фильтрат лиофилизируют, лиофилизат растворяют в буферном растворе кислого карбоната аммония (рН 7,9) и подвергают гель-хроматографии на колонке Сефадекс-С 10. Фракцию,осажденную между значениями ч /v 1,15 и 1,45, отделяют и лиофилизируют.

Таким образом получают 65 мг концентрата эффективного вещества (фракция Gl-3) в виде белого порошка.

Пример 2. Получение фракции

Gl-3 из селезенки теленка.

1000 r очищенной и измельченной селезенки теленка смешивают с охлажденным до 4 С ацетоном до получения о общего объема 4 л, смесь гомогенизируют при этой температуре в течение 60 мин, инкубируют и затем центрифугируют. Отделенное твердое вещество, промывают и высушивают в вакууме при 20 С.

Сухое твердое вещество экстрагируют 2 л хлороформа в течение 30 мин, затем твердое вещество отделяют, высушивают при комнатной температуре в течение 16 ч, после чего перемешивают с 3 л дважды дистиллированной воды и центрифугируют при 20000

13678

Т а блица 1

Селективное действие 100 мкг/мл СР на введение Н-тимидина в кислотонерастворимую дезоксирибонуклеиновую кислоту в культурах костного мозга и Thymus

Торможение в Thymuse

7 от контроля

Количество опытов

Торможение в костном мозге, Ж от контроля

<0,001 14,6

>0,2

53,2

59,9

7,3

Отделенную жидкость лиофилизируют, лиофилизат растворяют в 0,05 M буферном растворе кислого карбоната аммония (рН 7,9) и прдвергают гель-хроматографии на колонке Сефадекс G-15.

Фракцию, осажденную между значениями

v /v, 1,3 и 2,5, отделяют и лиофилизируют. Таким образом получают 3,54 г концентрата эффективного вещества

Gl-3 в виде белого порошка.

Пример 3. Получение чистого эффективного вещества GP.

300 мг концентрата эффективного вещества Gl-3 (полученного по примеру 1 или 2) наносят на хроматографическую бумагу ватман 3 мм (исходный пункт расположен в середине листа, и общее количество нанесенного образца распределяется по длине

30 см). Электрофорез проводят в буферной смеси из пиридина, уксусной кислоты и воды в объемном соотношении 90:4:900 (рН 6,5) в аппарате для электрофореза с горизонтальным рас- 25 положением с градиентом напряжения

50 В/см в течение 2 ч. Положение кислого положительно реагирующего на хлор и отрицательно на нингидрин компонента определяют по окраске 30 хлортолидином. Полученный таким образом активный компонент элюируют с бумаги буферной смесью из уксусной и муравьиной кислот и воды в объемном соотношении 8:2:90 (рН 1,9) и в такой же буферной смеси подвергают дополнительному электрофорезу с градиентом напряжения 80 В/см в течение

90 мин. Положение активного компонента определяют с помощью хлортолидина. Активный компонент элюируют такой же буферной смесью (рН 1,91) 37 4 и элюат лиофилизируют. Таким образом получают 8 мкг чистого эффективного вещества GP в виде белого порошка.

Пример 4. Получение действующего материала GP из крови теленка.

Из 10 л дефибринированной крови теленка посредством спонтанного осаждения выделяют фракцию, содержащую

867 гранулоцитов и 143 одноядерных клеток. Затем гемолизуют в течение

5 мин 0,852-ным раствором хлорида аммония, центрифугируют, осадок промывают физиологическим раствором поваренной соли. Полученные таким образом клетки гомогенизируют в буферном растворе и обрабатывают, как в примере 1.

Пример 5. Получение действующего материала GP из крови человека.

1 л крови от здоровых доноров,при- надлежащей к одной группе, подвергао ют осаждению при 4 С в течение 4 ч.

Полученные белые кровяные тельца содержат примерно 757 гранулоцитов и

25Х лимфоцитов. Затем клетки гомогенизируют в буферном растворе и обрабатывают, как в примере 1.

При этом по примерам 4 и 5 получено соответственно 60 и 5,6 мг концентрата активного вещества, обработанного, как в примере 3, с теми же характеристиками.

Результаты опытов,.проводимых in

vitro для определения эффективности выделенного с помощью ионообменной хроматографии или бумажного электрофореза эффективного вещества GP в сравнении с фракцией Gl-3, приведены в табл. 1 и 2.

7837 е моцитам, человеческим лимфоидным лейкемическим кровяным клеткам и Helia человеческим опухолевым клеткам.

Частично очищенная фракция G1-3

Э полученная в качестве промежуточного продукта в соответствии с предлагаемым способом, содержит также эффективное вещество GP, но не в чистом виде, а совместно с различными менее активными компонентами и, в основном, со значительным количеством неактивных примесей, такую же фракцию получают и по способу-прототипу. Данная фракция обладает также тормозящим действием против размножения миело- . идных клеток; in vitro минимальная эффективная доза фракции Gl-3 при торможении внедрения Н-тимидина в кислотонерастворимую ДНК 110 мкг/мл, в случае колоний †. 8 мкг/мл.

136

Та блица 2

Тормозящее действие на

Действующее вещество образовавведение Нтимидина в суспензионную культуру костного мозга, 3-4 ч ние колоний в капиллярах с гелем агара, 7 дней

Gl-3

М3К, мкг/мл

100

ЕР „, мкг/мл

430

GP

М3К, мкг/мл

2,5

0,2

Формула изобретения

ED о, мкг/мл 7,8

1,6

Способ получения средства, селективно тормозящего рост или размножение нормальных и лейкемических клеток миелоидов, путем выделения из крови человека или телят гранулоцитов или лимфоцитов, гомогенизации, центрифугирования гомогенизата в изотоническом .водном растворе с последующим отделением жидкой фазы, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, в качестве сырья используют кровь лошадей, которую гомогенизируют в буферном растворе с рН 7,4, затем после центрифугирования жидкую фазу подвергают молекулярному фильтрованию, отделяя фракцию с молярной массой не менее 10000, после чего выделенную фракцию наносят на хроматографическую колонку и отделяют фракцию, осаждающуюся между значениями v /v 1,15 и 1,45, которую лиофилизируют и затем очищают методом хроматографии и/или бумажным электрофорезом с последующей повторной лиофилизацией. .Шилина вчук Корректор С.Шекмар

МЭК вЂ” минимальная эффективная концентрация.

Следовательно, полученное в соответствии с изобретением эффективное вещество GP можно применять в качестве биологического эффективного вещества для торможения пролифера35 ции йормальных или лейкемических кровяных клеток. человека или клеток костного мозга in vitro в концентрациях от 0,2 до 10,0 пмоль/мл.

Новое вещество, выделенное из гранулоцитов вышеописанным способом в лиофилиэированной форме (эффективное вещество GP), обладает более эффективным действием: оно тормозит специфически размножение миелоидных клеток, но является неэффективным по отношению к нормальным тимоцитам, ПХА-стимулирующим лимфоцитам, субакутным лимфоидным лейкемическим ти5А

Составитель Л

Редактор Л.Веселовская Техред A.Kpa ао

Заказ 6853/57

Тираж 655 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная,4