Способ определения активности химотрипсина или трипсина в кале

 

Изобретение относится к биохимии, точнее к медицинской энзимологии, предназначено для определения активности трипсина иди химотрипсина в кале при диагностике хронического nanjc- реатита. Цель изобретения - упрощение способа путем сокращения числа стадий. Дпя этого измеряют скорость расщепления пригодного субстрата суспензии кала в водной или водно-органической среде, кал суспендируют в присутствии поверхностно-активного вещества (ПАВ) в концентра1щи 0,1- 3 мас,% и водорастворимых солей с ионной силой 20-1000 ммоль/л, рН 7,0- 11,0. В качестве ПАВ используют, например, анионные или амфолитические (производные глицерина с бетаиновой структурой, сульфобетаины, лецитины ) ПАВ (алкенсульфонаты, олефиновые сульфонаты, алкилнафталинсульфонаты, алкнлсульфаты, сульфаты: простых эфиров, жирных кислот, соли жирных и холевых кислот). Для фотометрического определения активности трипсина и химотрипсина целесообразно суспензию пробы центрифугировать перед измерением вплоть до осветления . 6 табл. СО

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

Ъ (59 4 0 01 N 33/48 33/68

Ф г

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

;1 г г гг гг.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

"Ф к,, ° ..., 4 г. „:г,г ;.; ...ггпу -,и

Н ПАТЕНТУ г (21) 3493078/28-14 (22) 10.09.82 (31) Р 3139719.0 (32) 06.10.81 (33) DE (46) 15.01.88. Бюл. М 2 (71) Берингер Маннхайм, ГмбХ (DE) (72) Геральд Меллер и Клаус Петер

Каспар (DE) (53) 612.015(088.8) (56) Willig F., Korber W.Z.Gastroen-.

tегоlogie, 1967, ч. 135, М 5, р. 3336. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ХИМОТРИПСИНА ИЛИ ТРИПСИНА В КАЛЕ (57) Изобретение относится к биохимии, точнее к медицинской энэимологии, предназначено для определения активности трипсина или химотрипсина в кале при диагностике хронического панкреатита. Цель изобретения — упрощение способа путем сокращения числа

SU ÄÄ 1367866 А 3 стадий. Для этого измеряют скорость расщепления пригодного субстрата суспензии кала в водной или водно-органической среде, кал суспендируют в присутствии поверхностно-активного вещества (ПАВ) в концентрации 0,13 мас.% и водорастворимых солей с ионной силой 20-1000 ммоль/л, рН 7,01l,0. В качестве ПАВ используют, например, анионные или амфолитические 1производные глицерина с бетаиновой структурой, сульфобетаины, лецитины) ПАВ (алкенсульфонаты, олефиновые сульфонаты, алкилнафталинсульфонаты, алкилсульфаты, сульфаты: простых эфиров, жирных кислот, соли жирных и холевых кислот). Для фотометрического определения активности трипсина и химотрипсина целесообразно суспензию пробы центрифугировать перед измерением вплоть до осветления. 6 табл.

1367866

Изобретение относится к биохимии, а именно к медицинской энзимологии, и может быть использовано для определения активности трипсина или химотрипсина в кале, проводимого при диагностике хронического панкреатита.

Цель изобретения — упрощение способа за счет сокращения числа стадий °

Способ осуществляется следующим образом.

Определяют активность химотрипсина или трипсина в кале путем измерения скорости расщепления пригодного субстрата суспензией кала в водной или водно-органической среде. при этом кал суспендируют в присутствии поверхностно-активного вещества в концентрации 0,1-3 мас.% и водорастворимых солей с ионной силои 20-1000 ммоль/л при рН 7,0-11,0.

Измерение скорости расщепления субстрата можно осуществлять любым известным способом, например путем титрования выделившейся аминокислоты с помощью раствора щелочи на рН-стате.

В присутствии поверхностно-активного вещества солюбилизируется более

90 % ферментной активности, скорость реакции расщепления субстрата значительно повышается, а кажущееся значение К для субстрата снижается (фактор активации равен 2-10). Благодаря этому можно также фотометрическим путем быстро, просто, точно и с незначительным расходом субстрата измерять его скорость расщепления, В качестве поверхностно-активного средства можно использовать любое пригодное поверхностно-активное вещество, например анионные или амфолитические поверхностно-активные вещества, предпочтительно неионогенные и особенно катионные поверхностноактивные вещества.

Анионные поверхностно-активные вещества представляют собой например, алкансульфонаты, олефиновые сульфонаты, в том числе куменсуль- . фонат, сульфонаты сложных эфиров, алкиларилсульфонаты, алкилбензолсульфонаты типа додецилбензолсульфоната и алкилнафталинсульфонаты; алкилсульфаты, в том числе лаурилсульфат натрия, сульфаты простых эфиров или сульфаты жирных спиртов, соли жирных кислот и холевых кислот. Амфолитические поверхностно-активные ве5

ЗО

35 шества представляют собой таковые с . анионоактивными и катионоактивными гидрофильными группами, например производные глицерина с бетаиновой структурой, сульфобетаины и лецитины.Неионогенные поверхностно-активные вещества представляют собой, например, простые полиэфиры, алкилфенолполигликолевые простые эфиры и другие продукты этоксилирования жирных кислот, амидов жирных кислот, жирных аминов и жирных спиртов, в том числе этоксилированный лауриловый спирт, полимеры из пропилена с этиленоксидом, полиоксиэтиленалкиловые простые эфиры или полиоксиэтиленнонилфениловые простые эфиры, полиоксиэтиленсорбитан-моно-олеат или лаурат, продукты присоединения пропиленоксида с этилендиамином и этиленоксидом, окиси аминов и сложные эфиры жирных кислот многоатомных спиртов,полиглико. левые простые эфиры спирта, получаемого из сала. Катионные поверхностноактивные вещества представляют собой, например, линейные и циклические аммониевые соединения, в том числе чис11-цетил-N этил-морфолинметосульфат, бензальконийхлориды и другие четвер-. тичные аммониевые соли, соли аминов, соли пиридииия или четвертичные (жирный амин) — полигликолевые простые эфиры.

Выбор оптимального пригодного поверхностно-активного вещества зависит также от прочих реакционных условий, в особенности от рода фермента и субстрата, от рода и концентрации солей, а также от рН среды.

Из пригодных для предлагаемого способа катионных детергентов сильным активирующим эффектом обладают аммониевые соединения, предпочтительно формулы R,R,É (СН,)>., где В,— предпочтительно алкильный остаток с 9-14 С-атомами, главным образом лаурил и цетил; R.. — предпочтительно низший.алкильный остаток с 1-5 С-атомами или аралкильный остаток, или оксиалкильный остаток, особенно метил или бензил, а также алкилпиридиниевые соли, предпочтительно с 1218 атомами углерода в алкильном остатке, например лаурилпиридиниихлорид, лаурилпиридинийсульфат, особенно гексадецилпиридинийхлорид. Особенно хорошо пригодным для предлагаемого способа поверхностно-активным веще1367866

30

40

55 ством является лаурил-триметил-аммонийхлорид.

Концентрация пробы кала в суспензии составляет 0,2-2 7..

Используемый для суспензии кала раствор для гомогенизирования наряду с поверхностно-активным средством содержит еще одну или несколько водорастворимых солей, например хлориды или сульфаты щелочных и/или щелочно-земельных металлов. Особенно целесообразно содержание NaC1 1001000 ммоль/л или СаС1 20

500 ммоль/л, или комбинация обеих солей в пределах указанных концентраций. Пригодны также органические соли, например ацетаты или цитраты, а также соли других катионов. Соли должны быть в концентрации, которая соответствует ионной силе 20—

1000 ммоль/л. При этом установлено, что благодаря содержащему поверхностно-активное вещество и соли раствору для гомогенизирования происходит сверхаддитивное увеличение активности фермента (повышение скорости реакции), т.е. увеличение, большее суммы величин, полученных в присутствии поверхностно-активного вещества или солей. Затем лишь с помощью комбинации соли с детергентом можно перевести значительную часть связанного с частицами фермента трипсина или химотрипсина в раствор.

В качестве субстрата можно использовать любой известный субстрат для определения активности химотрипсина или трипсина в кале известными методами.

Для определения химотрипсина фотометрически особенно пригодным прежде всего в отношении водорастворимости, стабильности, значения К и константы скорости оказался АланилI. аланил-фенил аланил-.п-нитроанилид, особенно сукцинил-аланил-аланил-пролил-фенилаланил-нитроанилид и МеОсукцинил-аргинил-пролил-тирозил-пнитроанилид. Хорошо пригодным субстратом для определения активности трипсина является хромоцим THY (карбобензокси-валил-глицил-аргинилп-нитроанилид-ацетат).

Для приготовления раствора реактива субстрат растворяют в воде или в смеси воды с органическим растворителем. Органический растворитель при этом служит в качестве агента растворения для субстрата и представляет собой, например, ацетонитрил, диметнлсульфоксид, ацетон или метанол. Раствор реактива содержит предпочтительно также еще те же соли, что используются для раствора при гомогенизации. Концентрация этих солей в растворе реактива в общем ниже концентрации в растворе для гомогенизирования. Общая концентрация солей составляет предпочтительно примерно 10 — 500 ммоль/л, например

250 ммоль/л хлорида натрия и

20 ммоль/л хлорида кальция, Для проведения измерения определенное количество суспенэии пробы кала в растворе для гомогенизирования ипи определенное количество полученного путем центрифугирования вплоть до осветления верхнего слоя жидкости после центрифугирования добавляют к определенному количеству раствора реактива (например, 0,1 мл испытуемой суспензии к 2 мл раствора реактива) и титрометрически или

Аотометрически определяют скорость расщепления. При выборе количества испытуемой суспензии (разбавление пробы кала) руководствуются достижением хороно измеримых значений, например, экстинкции/мин прежде всего в зависимости от ожидаемой активности фермента. На основании увеличения чувствительности за счет использования детергента количество пробы может выбираться настолько малым, что собственное поглощение суспендированного твердого вещества незначительно и таким образом становится возможным фотометрическое измерение в присутствии суспензии. Рекомендуется добавление к растворам буферной смеси для установления значения рН 3-10, например, 45 трис-буфера, глицинового буфера или глицилглицинового буфера. Концентрация буфера составляет в общем 101000 ммоль/л, оптимально 50—

200 ммоль/л.

Измерение можно осуществлять вручную или с помощью автоматического анализатора. Для фотометрического определения активности и в особенности для автоматического фотометрического измерения (определения экстинкции) целесообразно суспензию пробы центрифугировать перед измерением вплоть до осветления.

29,5 мг (0,5 ммоль/л) 2р

1,46 r (250 ммоль/л)

222 мг (20 ммоль/л) NaCl

5 1 3678

Пример l. Определение активности химотрипсина.

Раствор дпя гомогенизирования:

NaC1 2,9 г (500 ммоль/л)

СаС3 l ° 1 г (100 ммоль/л)

Лаурилтриметыаммонийхлорид 10 (ЗЗЖ-ный) 2,0 г (0,7 7.)

Дистиллированная вода До 100 мл

Раствор реактива: 15

Сукцинил-аланилала ныл-пролилфенилаланил-пнитроанипид

Буфер трис-НС1, 25 рН 9,0 60 ммоль/л до общего объема 100 мл

Гомогениэирование пробы.

Примерно 100 мг пробы кала смеши- 30 вают со 100-кратным весовым количеством раствора для гомогенизирования и в пригодном сосуде гомогенизируют до высокодисперсной суспензии.

Осуществление измерения.

В спектрофотометрическую кювету с длиной оптического пути l см пипеткой вносят 2 мл раствора реактива, термостатитруют при 25 С и смешивают с 0,1 мл гомогената пробы. По" 40 сле кратковременного перемешивания определяют прирост экстинкции в минуту при 405 нм. Для расчета активности фермента на 1 г кала прирост экстинции/мин при 405 нм нужно умножить 45 на фактор 212.

Пример 2. Приготовление раствора для гомогенизирования и раствора реактива, а также гомогенизи- . рование пробы осуществляют по примеру 1. Затем суспенэию центрифугируют до осветления раствора.Из верхней части жидкости после центрифуги« рования отбирают аликвотную часть и определяют активность фермента либо вручную (по примеру 1), либо при использовании автоматического анализатора.

66 е

Пример 3. а Приготовление раствора для гомогенизирования.

Готовят водный раствор из следующих составных частей: трис-НСl-буфер, рН 9,0 60 ммоль/л

NaCl 250 ммоль/л

Сас1, 20 ммоль/л

Лаурил-триметиламмонийхлорид 0,6 Ж

Приготовление раствора реактива, гомогенизирование пробы и осуществление измерения осуществляют согласно примеру 1.

Полученные данные по активности химотрипсина в пробах кала представлены в табл.l.

Пример 4. Приготовление раствора для гомогенизирования аналогично примеру 1..

Приготовление раствора реактива.

Водный раствор готовят иэ следующих составных частей, ммоль/л

Аланил-аланилфенилаланил-п-нитроанилид 2

NaC1 250

Сас1 20 трис-НСl-буфер, рН 9

Гомогенизация пробы.

200 мг пробы кала смешивают с

10 мл раствора для гомогенизирования и обрабатывают в пригодном сосуде вплоть до образования высокодисперсной суспензии..Осуществление измерения.

В кювету с длиной оптического пути 1 см пипеткой вносят l мл раствора реактива, термостатируют при 25 С и смешивают с 0,02 мл гомогената пробы. После кратковременного перемешивания определяют прирост коэффициента экстинкции при 405 нм. Активность составляет 45 мЕд/мин. Hp и м е р 5. Приготовление раствора для гомогенизирования аналогично примеру 1.

Приготовление раствора реактива.

Готовят водный раствор из следующих составных частей, ммоль/л:

3-Карбометоксипропионил-1--аргинилL-пролил-L-тирозинп-нитроанилид-гидрохлорид 0 5

NaC1 250

1367866

5

20 20

55

СаС1 трис-НС1-буфер, рН 9,0 60

Гомогенизирование и измерение осу5 ществляют согласно примеру 1.

Активность составляет 148 мЕд/мин.

Пример 6. Определение активности трипсина.

Раствор для гомогенизирования го- 10 товят аналогично примеру 1.

Приготовление раствора реактива.

Готовят водный раствор из следующих составных частей, ммоль/л:

Карбобейзокси- 15

?валил-?глицилЬ-аргинин-пнитроанилид-ацетат

NaC1

СаС1 трис-НС1-буфер, рН 9,0 60

Гомогенизирование и измерение

L осуществляют согласно примеру 1.

Активность трипсина составляет 25

8 мЕд/мин.

Пример 7. Определение активности химотрипсина.

На фильтровальную бумагу наносят пробу кала, затем обрабатывают ее 30

0,05 мл водного солюбилиэирующего раствора, состоящего из:

Лаурилтриметиламмонийхлорид 50 г/л (5Х)

NaC1 500 ммоль/л

СаС1 100 ммоль/л

Затем фильтровальную бумагу обрабатывают 0 05 мл раствора реактива следующего состава:

Сукцинил-аланил- 40 аланил-пролил, фенилаланил-пнитро анилид 2 ммоль/л, N-g-Нафтилэтилендиамин 5 г/л

Нитрит натрия 1 г/л

Буфер трис-НС1, рН 9,0 100 ммоль/л

Спустя 5 мин на бумагу наносят

1 каплю трихлоруксусной кислоты (3,2 ммоль/л) ° В присутствии химо-. трипсина в пробе появляется интенсивное фиолетовое окрашивание, величина которого зависит от количестsa фермента.

Пример 8. Определение активности химотрипсина с различными детергентами при разных их концентрациях.

В табл.2 и 3 представлены данные по измерению активности химотрнпсина в суспензии кала и супернатанте по примеру 1 при варьировании детерrентов и их концентрации.

Пример 9. Определение активности химотрипсина при граничных значениях ионной силы.

В табл.4 и 5 представлены данные по активности химотрипсина (при определении по примеру 1) при разных значениях ионной силы.

Пример 10. Определение активности химотрипсина при разных значениях рН.

В табл.6 представлены данные определения активности по примеру 1 при разных значениях рН.

Формула изобретения

Активность химотрипсина, мЕд/мин

Проба

181

42 3

159

Способ определения активности химотрипсина или трипсина в кале путем измерения скорости расщепления субстрата в присутствии суспензии кала в водной и водно-органической среде с последующим определением продукта расщепления субстрата,о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения способа за счет сокращения числа стадий, кал суспендируют в присутствии

0,1-3 мас.X поверхностно-активного вещества и водорастворимых солей с ионной силой 20-1000 ммоль/л, а определение ведут при рН 7,0-11,0.

1367866

Активность химотрипсина, мЕд/мин

Детергент, 1 мас.X

Суспензия

Беэ детергента

10,2

5,8

Полиоксиэтилен-сорбитанмоноолеат

70,2

71,0

Полиок сиэтилен-сорбитанмонолаурат

75,3

72,4

Полиоксиэтилен-нонил-эфирфенол

58 3

55,) Жир-спирт-полигликолевий эфир

68,3

64,9

83,2

79,4

Оксиэтил-алкил-аммонийхлорид . 80,5

75,3

N-цетил-N-этил-морфолин-метосульфат

74,8

79,3

85 2

Лаур ил- триме тил-аммо нийхлорид

Т аблица Э

Активность химотрипсина, мЕд/мин при концентрации детергента, мас.7

Проба

0,1 0 5 3

118

115 120

130 130

131

Суспензия

2.Надосадочная жидкость

60

62

Суспензия

21

Суспензия

Лаурил-пиридинхлорид

1.Надосадочная жидкость

3.Надосадочная жидкость

Таблица 2

Надосадочная жидкость

1367866

Таблица 4

Активность+ химотрипсина, мЕд/мин

Проба

О/О 7/20 333/1000 !

1. Надосадочная жидкость

30

34

35.

Суспензия

2. Надосадочная жидкость

48

l

50

Суспензия

46

Условия определения: в числителе — концентрация, а в знаменателе — ионная сида хлористого кальция, ммоль/л, 1

Таблица 5 тивность+ химотрипсина, мЕд/мин

1000/1000

Проба

/О 20/20

1.Надосадочная жидкость

28

84

85

Суспензия

2.Надосадочная жидкость

122

123

128

129

127

Суспензич

Условия определения: в числителе — концентрация, а в знаменателе — ионная сила хлористого натрия, ммоль/л. ,Таблица 6 тивность химотрипсина, мЕд/мин

Буфер

Глицилглицин-НС1

Трис-НС1

Ацет натр

t: T

3,0,О 7,0. 9,0 10,0

Значение рН

Проба 1. Надосадочная жидкость

65 65 64 65 63

68 70 69 68 65

Суспензия

Проба 2. Надосадочная жидкость

90 92 91 95 92

97 99 95 102 90

Суспензия