Способ выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты из дезоксирибонуклеопротеидов

 

Изобретение относится к области биохимии в биотехнологии и позволяет получать с помощью солевой депротеинизации без воздействия потенциально денатурирующих агентов в виде детергентов и органических растворителей высокополимерные концентрированные препараты ДНК (4-6-10 Дальтон, 0,2 мг/мл) с высоким выходом (94%) и содержанием белка менее 1%. Цель изобретения состоит в повышении выхода и степени очистки высокополимерных концентрированных препаратов ДНК. Изобретение заключается в удалении белков из раствора ДНП, депротеинизированного солью, путем связывания белков высокодисперсными сильнокислыми катионитами при постепенном понижении ионной силы раствора с помощью диализа. 1C

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

f5@ 4 С 07 Н 21/04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4095669/28-13 (22) 21.07.86 (46) 15.02,88. Бюл. У 6 (71) Институт медицинской генетики

AMH СССР (72) В.Д.Папонов, П.С.Громов и С.П.Радько (53) 575.224.2 (088.8) (56) Biochim. et. Biophys. Acta, 1967, ч. 140, р. 561 564. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОПРОТЕИДОВ (57) Изобретение относится к области биохимии в биотехнологии и позволяет получать с помощью солевой депротеи„„SU„„1373709 А 1 низации без воздействия потенциально денатурирующих агентов в виде детергентов и органических растворителей высокополимерные концентрированные препараты ДНК (4-6 10 Дальтон, 0,2 мг/мл) с высоким выходом (947) и содержанием белка менее 17. Цель изобретения состоит в повышении выхода и степени очистки высокополимерных концентрированных препаратов

ДНК. Изобретение заключается в удалении белков иэ раствора 31111, депротеинизированного солью, путем связывания белков высокодисперсными сильнокислыми катионитами при постепенном понижении ионной силы раствора с помощью диализа.

1373709

11зобретеш?е относится к би . 1.13131 биатехноло! IIII и может б??т! ?п.иользона»о н науч??ых лаборатор??ях биохими ?еского б3!031 изическ01 0 1?олеку5

)!$?р?10С)поло! 3! ?ес?(ого Ilpor1!IC)1$1» JI upoмы?1?$?е?и?ом производстве для получения зуется нс н )зиле qe!f110 f elf!!Jf!«J)y!nfrего /,,!Ill агента, а н н?1)3е ацсорбента, ко??к,".)31?зу?о?130! 0 с 7IIII за Ge.-?;Jf р Ifpo- 25

l3CCCO y11еНЬfI,ЕНИя СОЛЕВОЙ КоицЕ»траЦИИ Д!?аЛИЗОМ От $3OIIPOXO)3?I!3 ) IIPylar !elf

ДНП до физиологической. I «»o?!IIT про!?ста)3$?якзан,ий собой clfoJ!raff!10 ссJ) if! .: ? 3 иру!011!IIL I ранулы (15, 5

19,5 мкм), осаждается нмссте со сня:-.» :!н?cs? бе$!1(011, и пре??врат 1НК ocIaeтся н надосадке в ниде раствора.

ОCEIÆ!;,о I!110 1(аТ! IO!!I!! а "IO 3(II(), C! ° 0 ð3! I b

3IeIIтрифугиро!заш?ем C!Ic-си ио .:10;и!а35

:п?за.

П р 31 м е р 1. 20 г снежез -r! Iopo1K(!IIII(й ТI;(11?JI Т??муса те IC!!I(а )I, ?осlb ?азот 11 $1,3?спер! 3?руla! в 300 м,? стal!дарт??ого раствора (0,075 И N;3Cl +

+ 0,0243 И Na.„. ЗДТЛ, pll 8,0) с по?"?ощь?о

30 ножен)ого 0мо! он»затора при

1? СОО об/ми?? 33 течение 2 мин. 1 o fore!3(3ò фильтруют через 4 с!!OR 1. арли

1IcII" рифугируют 10 м?ш ири 000 g.

Падосадок удаляют, а осадок нноззь дисис;)гируют в 300 мл cTаи))артиого

pac l 130p;J 13 1 омоl с»из ITOpc upu

8000 об/мин н течеш!с 20 с «вновь осаждают при том же режиме центрифу50

31fpoJ3alIJl$I. Последняя операция отмывки осаждсвощегося хроматина от рибонуклсопротеидов повторяется 6 раз.

Бось !«)ouecc выделения ДНП проводят при 4 С. После последней отмывки по55 лучеш?ый ДНП диспергируют н О, 15 М ,NaC1 + 0,7 мИ Иа-фосфатном буфере (pII 7,0), Дисперсия разба1зляется до состояния, когда она со;1ерж??т конс помощью простейших операц??й и практически безотходной техно Io! 1111 нысоI(o r I J I (т ьl х и р е и а р а т О 13 н ы с 0 к () и 0 х!: 1 ?е 1) I l o l I 1 р

Д11К, наиболее приближенной к IIa! 3113ному состояшно. ! пель изобрс.тония — повышение выхода II степе? III очистки нысс.?(0»0.?»мери ?х (4-6 10 Дальтон) (0!, I » !pl!- 15

poI! a!!If? (О," мг/мл) препарато)з ДН1<.

Повышение ?зыхода и степени очистки обеспечивается н резулт тате испол»ни?)а??»я н I(ar.foe òне Ilçá!IJ»! TE. .:Iüногс алсорбеита для отделения белка 2р

o 1, 11 и!1 ь»01:ис-10 1 ?!01 0 " i!(())1; ()„ 1»с персногo катион»та. IСа тио:.;и исиольцентрацию ДНК, вдвое превышающую необходимую исследователю концентрацию препарата. Последняя в нашем случае составляла 0,2 мг/мл. К дисперсии п?з31?шзают равны!1 объем раствора

И МаС1 на фосфатном буфере и получен?п ?й раствор (С„„„=О, 2 мг/мл) ина кубируют не менее 3 ч при 4 С. Ка-!

3!o«3Iv Aminex А6, BRL ° США (15 смэ ) диспергируют в 30 мл 2 M NaC1 и через 30 мин центрифугируют при 1500 g н течение 1 мин, Надосадок сливают и добанля?от двойной объем (30 мл) полученного ранее раствора ДНП в 2 М 131аС1.

Катионит тщательно перемешивают с раствором до однородной консистенции и помещают н воронку, широкий конец которой закрыт целлофаном, закрепленным резиновым кольцом в цилиндрической части воронки. В воронку помоща?от Г-образную стеклянную палочку, нращаемую в смеси электромотором со скоростью 10 об/мин для предотвращен»л оседания гранул катионита. Ниж ш?й конец нороики погружают в сосуд с ф??зиологическим раствором (О, 15 M !

1аС1 + 0,7 мМ 1)1а-фосфатный буфер, рН 7,0, объем 1 л), перемешиваемым

С ПОМОЦЬЮ МагнитНОй Мешалки. Диалиэ о проводят 12 ч при 4 С. Затем смесь

3!з ?зоро»1(и центрифу! 33ру?от при 1500 я

1 мин. Надосадок представляет собой препарат ДНК в ниде раствора с концентрацией ДНК 0,2 мг/мл в среде с физиологической ионной силой. Растноритель можно выбрать с меньшей ионной силой, что не сказывается на качестве препарата ДНК.

Пример 2. Операции выделения ДНК из ткани тимуса теленка соответствуют примеру 1. Препарат ДНК, выделешп?й в физиологической среде (0,15 M NaC1) переводят в 2 М NaC1 добавлением равного объема раствора

4 II . 1аС1. 16 мл ДНП в 2 И 1)1аС1 при

С3,3„ = 0,2 мг/мл инкубируют в течение 3 ч при 4 С для растворения препарата. Катионит Озсзоп !Л1А11(16 мл) диспергиру?от в 32 мл 2 И 131аС1 и через 30 мин центрифугируют при 1500 g н течение 1 мин. Надосадок сливают и добавляют 16 мл раствора ДНП в

2 M NaC1, Объемное отношение в смеси катионит/ДНК = 1. Смесь тщательно перемешивают, а затем проводят удаление соли диализом. Диализ ведут против 1 л раствора 0,15 M NaC1 +

+ 0,7 мМ 1)1а-фосфатный буфер (рН 7,0) 1373709

1О

Предлагаемый способ позволяет получить препараты ДНК с массой, определенной методом вискоэиметрии, 1

4-6 10 Дальтон, с содержанием белка менее 17 при Сдщ, = 0,2 мг/мл. ВыСоставитель Т. Забойкина

Редактор Н.Киштулинец Техред М.Моргентал Корректор М.Демчик

Заказ 533/19 Тираж 348

ВНИИПИ Государственного, комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 либо против 0,7 MM Na-фосфатного буфера (рН 7,0) в течение 16 ч при 4 С

Смесь центрифугируют 30 с при 2700 g.

Надосадок представляет собой раствор

ДНК в физиологическом растворе. Характеристика полученного препарата

ДНК: белок/ДНК 0,01р Срц =0,2 мг/мл выход ДНК иэ ДНП составил 887.. Молекулярная масса препаратов ДНК, полученных на данном катионите, находится в диапазоне 4-6 10 Дальтон. ход ДНК иэ препаратов ДНП составляет

88-947.

Формула и з о б р е т е н и я

Способ выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты иэ деэоксирибонуклеопротеидов с помощью солевой депротеинизации, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повьпиения выхода и степени очистки высокополпмерных концентрированных препаратов

ДНК, удаление белков иэ раствора прс водя.г путем сорбции их на высокодигперсных сильнокислотных катионитах, понижая ионную силу раствора с помощью диализа, при этом ДНК остается в растворе.