Способ получения фактора уш:с свертывания крови

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„ЯЦ„„1 7511 (5д 4 А 61 К 35/14

3CF. ..:. -" - : "%

1! 13,-„, 131

ЪИБЛР " ;

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3611812/28-14 (22) 21. 06. 83 (31) 392929 (32) 28. 06 ° 82. (33) V S (46) 15. 02. 88. Бюл. 9 6 (71) Монсанто Компани (V S) (72) Джон Харпстер Джонсон (VS) (53) 612. 015 (088. 8) (56) Biahim. Biophys. Acta, 1981, vol. 668, р. 456-470. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФАКТОРА УШ:С

СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ .(57) Изобретение предназначено для выделения препаратов свертывания крови. Цель изобретения — увеличение выхода целевого продукта. Плазму под-. вергают адсорбции с применением двух водонерастворимых сшитых полиэлектролитных сополимеров в присутствии гепарина. Смола А — сополимер этилена и малеинового ангидрида, сшитый с метилиминобиспропиламином, содержащий концевые диметиламинопропилимидные группы. Смола Б — сополимер этилена и малеинового ангидрида, сшитый с диметиламинопропилимпдом. В смоле Б все свободные карбоксильные группы защищены метоксипропиламином. После обработки плазмы крови смолами А и Б получают фильтрат, который концентрируют и частично обессоливают, пропуская через полупроницаемые мембраны. 2 табл.

1375116

12 г смолы диспергируют в 200 мл

0,154 M NaC1, содержащего 0,17. альбумина сыворотки крови крупного рогатого скота (АСК). С помощью 1,0 M лимонной кислоты устанавливают рН 4,0. Диспергирование проводят в . 55 течение 3-5 мин при перемешивании.

Суспензию отфильтровывают, фильтрат отбрасывают. Получают влажную смоляную фильтр-прессную лепешку, котоИзобретение относится к медицине, в частности к области фракционирования крови и выделения препаратов свертывания крови.

Цель изобретения — увеличение

5 выхода целевого продукта — фактора

УШ: С.

Цель достигается за счет функционирования плазмы крови при определенных значениях рН с использованием двух водонерастворимых сшитых полиэлектролитных сополимеров, применяемых в присутствии экзогенного гепарина. 15

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Кровь человека переливают в пластмассовые мешочки, содержащие противосвертывающее ве- 20 щество — CPDA-1 (цитратное, фосфатное, декстразовое противосвертывающее вещество с адепином — антикоагулянт-США). Отделяют плазму центрифугированием при силе 500-4000 g в 25 течение 4 ч, при 20-24 С. Порции плазмы по 200 мл замораживают при

-2U С.

Самозамороженную плазму подвергают . адсорбции при комнатной температуре с применением двух водонерастворимых сшитых полиэлектролитных сополимеров (смол) в присутствии экзогенного гепарина. Смола А — сополимер эквимолярных количеств этилена и малеинового ангидрида, сшитый с 5 мол.7. метилиминобиспропиламина, содержащий

90 мол.7. концевых диметиламинопропилимидных групп. Смола Б — сополимер этилена и малеинового ангидрида, сшитый с 5 мол.7 диметиламинопропилимида, содержащий 5 мол.7 концевых диметиламинопропилдиимидиых групп.

В смоле Б все свободные карбоксильные и ангидридные группы защищены метоксипропиламином.

До применения смолу Б предварительно обрабатывают следующим образом. рую вновь диспергируют в 200 мл

NaC1/ÀÑÊ. Добавляя при перемешивании

1,0 M NaOH устанавливают рН 5,8.

Перемешивание продолжают еще 10 мин.

Суспензию отфильтровывают, а влажную лепешку используют для последующего фракционирования.

Все растворы, используемые при элюировании и в процессе фракционирования содержат 0,17 АСК.

Натриевую соль свиного гепарина используют в виде раствора 200 ед/мл в физиологическом растворе.

Процесс фракционирования осуществляют следующим образом.

Один мешочек (т.е. 200 мл) свеже замороженной плазмы быстро оттаивают., помещая его в перемешиваемую водян -; о баню при 37 С. Затем добавляют в смесь 1 мл раствора гепарина (т.е-.

200 ед), перемешивают смесь 3-5 мин.

Отбирают пробу для проведения испытания на коагуляцию (регистрируют объем и время). Контрольные пробы идентичны испытуемым, однако без добавления гепарина в плазме.

К плазме добавляют 70 мг смолы А, значение рН доводят до 8,0 с помощь.1 M NaOH, выдерживая это значение рН при перемешивании смеси в течение

20 мин. Затем смесь фильтруют, полученный фильтрат содержит большую часть активности фактора УШ:С.

Иокрую смоляную лепешку промывают

20 мл дистиллированной воды, перемешивают 5 мин, фильтруют и два полученных фильтрата собирают и испытывают на фактор УШ;С. Регистрируют объем активности для подсчета общего количества единиц-коагулирования.

К фильтрату добавляют предварительно обработанную смолу Б (12 г), добавкой 1 M лимонной кислоты доводят рН до 5,8 и суспензию перемешивают 20 мин, выдерживая рН 5,8. Сус= пензию отфильтровывают, осадок промывают 200 мл 0,002 M NaC1. Затем осадок диспергируют в 200 мл 0,3 И

NaCl устанавливают рН 5,8, суспензию перемешивают 5 мин, снова фильтруют, промывают осадок дополнительными 200 мл 0,3 M NaC1, а фильтрат отбрасывают.

Фильтрованный осадок вновь диспергируют в 200 мл растворителя для элюирования, содержащего 1,5 M NaC1

0 1 И лизин и 0,17 АСК. Устанавливают рН 6,0 и перемешивают суспензию

l 375116

Таблица 1

Контрольные пробы без добавки гепарина

44,0

145

72,5

68,5

38,0

137

20,5

106

53,0

20 мин. Суспензию отфильтровывают и осадок промывают 20 мл растворителя элюирования, после .чего отбирают пробу фильтрата для испытания на коагуляцию, как указано в табл. 1 °

Фильтраты, содержащие 40-70Х первоначальной свертывающей активности фактора УШ:С в очищенном виде, концентрируют и частично обессоливают, пропуская через полупроницаемые мембраны (Millipore Pellicon Cassette filtration system или Amicon

ВН4 hollow fiber concentrator system). 15

Концентрированный раствор сушат вымораживанием и упаковывают для их хранения.

В табл. 1 приведены результаты нескольких проходов фракционирования с использованием собранной плазмы стабилизированной СРДА, иллюстрирующие благоприятное действие добавления гепарина к плазме в сочетании с использованием смол А и В. 25

Определение фактора УШ:С осуществляют путем индикации начала процесса свертывания. Измеряют вторую произ-. водную скорости коагулирования (т. е. скорости изменения скорости коагулирования). В качестве контроля используют плазму, в которой отсутствует фактор УШ:С, при этом в качестве активатора используют эллаговую кислоту.

Определяют время коагулирования на серийных разбавлениях используемых фракционированных проб. Полученные результаты выражают как процент выделения активности фактора УШ:С, считая на степень активности первоначально собранной пробы плазмы.

Первоначальная проба считается содержащей i ед активности коагулирования фактора УШ:С на 1 мл. Каждое из испытаний начинали с общего количества

200 ед коагулирования. Наконец регистрируют кумулированную единицу и процент выделения активности после каждой обработки смолой.

Пример 2. Способ осуществляют, как описано в примере 1, эа тем исключением, что к исходной плазме до обработки смолой А и к фильтрату до обработки смолой Б добавляют три разные концентрации гепарина.

Результаты представлены в табл. 2.

Формула из обре те ния

Способ получения фактора УШ:С свертывания крови путем фракционирования его из крови адсорбцией на водонерастворимом сшитом полиэлектролитном сополимере с последующим элюированием целевого продукта с адсорбента, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, плазму крови при рН 8,0 смешивают с 0,035 мас.Х сополимера этилена и малеинового ангидрида, сшитого в присутствии 0,11,0 ИЕ/мл гепарина с 5 мол.Х метили-., минбисопропиламина, содержащего

90 мол.Х концевых диметиламинопропилимидных групп, с последующим отделением супернатанта, в который при рН 5,8 добавляют 6Х сополимера этилена и малеииового ангидрида, сшитого с 5 мол.Х метилиминобиспропиламина, содержащего 5 мол.Х концевых диметиламинОпрОпилимидных групп, при этОм свободные карбоксильные и ангидридные группы блокируют добавлением метоксипропиламином в присутствии 0,11,0 ИЕ/мл гепарина.

1375116

Продолжение табл.1

42,0

72,0

144

52,5

105

63,74.10, 1 76,0+21,0

Mim 1271 20

59,0

118

85,5

1?1

60,0

120

95,0

190

112

56,0

83,0

166

109

54,5

82,0

164

139

69,5

1 02, 0

204

59,8+5,9

120<12 0

93,9+13,5

M+m 188>27,0

Таблица 2

Количество добавленного гепарина, ед/мл

Активность

1,0 0,5 0,1

Активность, выделенная из смолы А, Ж

96+14

91 6

Кумулированная активность, выделенная из смолы Б, Е

53+5

53+17

Одна серия испытаний.

Составитель А. Агуреев

Редактор M. Недолуженко Техред Л.Сердюкова Корректор М.Максимишинец

Заказ 622/57 .Тираж 655 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Пробы, обработанные гепарином (1,03 ед/мл) +

В пересчете на активность первоначальнои плазмы.

I 1

46,5

38,?+10,4