Способ определения альфа-токоферола в бислойных липидных мембранах

 

Изобретение относится к биохимии . Лдя раздельного определения / токоферола в наружном и внутреннем монослоях бислойньЕХ ЛИПИДНЫХ мембран из одной части исследуемой пробы экстрагируют липидрастворимые соединения и определяют содержание «( -токоферола , К другой части добавляют ферри1щанид калия, экстрагируют пиды и определяют содержание ef -токоферола во внутреннем монослое. Содержание (/-токоферола в наружном монослое определяют по разности его суммарного содержания и содержания во внутреннем монослое. 1 табл.

„„SU„„) 394131

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51) 4 G 01 N 33/48 A 61 К 31/355

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМ У СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4005174/28-14 (22) 21Ä10.85 (46) 07.05 ° 88. Бюл, Р 17 (71) Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И,И. Сеченова (72) В.Е. Каган, В.А. Тюрин (SU), Е.А. Сербинова и Ц. С. Стойчев (BG) (53) 612.015(088 8) (56) Hansen L.F. Warwick W.J. Amer.

J. Clin. Pathol 1966, v.46, р. 131 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЬФА-ТОКОФЕРОЛА В БИСЛОИНЫХ ЛИП1ЩНЫХ ИЕИБРАНАХ (57) Изобретение относится к биохимии. Для раздельного определения o(токоферола в наружном и внутреннем монослоях бислойных липидных мембран из одной части исследуемой пробы экстрагируют липидрастворимые соединения и определяют содержание et -токоферола. К другой части добавляют феррицнанид калия, экстрагируют ли, пиды и определяют содержание Ф -токоферола во внутреннем монослое. Содержание e(-токоферола в наружном монослое определяют по разности его суммарного содержания и содержания BO внутреннем монослое. 1 табл.

1394131

Интенсивность флюоресценции, отн.ед.

Содержание альба-токоферола, мкг

37 72 108 145 182 298

1,0 2,0

Изобретение относится к биохимии !

Й может быть использовано для разельного опредсления альфа-токоферола (витамина Е) в наружном и внутрен5 нем моиослоях искусственных и природных бислойных липидных мембран.

Цель изобретения — раздельное определение альфа-токоферола в наружном и внутреннем монослоях бислойных ли1шдных мембран. !

Способ осуществляется следующим образом.

Из одной части исследуемой пробы экстрагируют липидрастворимые соединения, в экстракте флюориметрически определяют общее содержание альфа токоферола. Затем в другой части ис, следуемых мембран проводят селектив1 ное окисление альфа-токоферола наруж- 20, ного монослоя мембран, Феррицианидом калия экстрагируют липиды и флюори-! метрически определяют в экстракте со,. держание альфа-токоберола во внутреннем монослое. Содержание альфа-токо- 25 ферола в наружном монослое определяНа следующем этапе процедуры включают альфа-токоферол в наружный и внутренний монослой бислойных липидных везикул, сформированных из липидов плазматических мембран синаптосом мозга крысы, Для этого берут

1,0 мл раствора хлороформа, содержа- 40 щего 10 мг фосфолипидов, и смешивают с 1,0 мл хлороформа, содержащего

10 мг альфа-токоферола. Смесь упари1 вают досуха в токе аргона, затем добавляют 10,0 мл среды следующего 45 состава: трис-НС1 (20мИ), NaCI (100 мИ), рН 7,4,интенсивно встряхивают 3-5 мин. Полученную суспенэию подвергают ультразвуковой дезинтеграции на ультразвуковом дезинтеграто-50 ре УЗУН-2 (режим работы 22 кГц, воздействие ультразвуком по 15с в тече4 о ние 10 мин при 0-4 С). После ультразвуковой обработки суспензию центрифугируют 20000 g, 20 мин. Супернатант представляет собой бислойные липидные везикулы, в наружный и внутренний монослой которых включен альфа-токоферол, ют по разности его суммарного содержания и содержания во внутреннем монослое.

П р и и е р 1, На первом этапе процедуры строят калибровочную зависимость интенсивности блюоресценции альфа-токоферола от его количества.

Для этого берут навеску альфа-токоферола 10 мг и растворяют в 10 мл метанола, Из этого раствора берут микрошприцом разное количество альфатокоферола (1, 2, 3, 4, 5, 8 мкл) и каждую добавляемую часть смешивают с 3,0 мл метанола. В приготовленных образцах регистрируют интенсивность флюоресценции альфа-токоферола на спектрофлюориметре "HITACHI MPF-2A

Условия регистрации следующие: спектральная ширина щелей 4 нм, 295 нм; h» « = 325 нм, в 1 см кюветы объемом 3,0 мл при комнатной температуре.

Значения интенсивности флюоресценции от содержания альфа-токоферола приведены в таблице.

3,0 4,0 5,0 8,0

В полученных липидных везикулах определяют суммарное количество альфа-токоферола. Для этого берут 5,0 мл супернатанта и разделяют на пять параллельных проб по 1,0 мл, затем экстрагируют липиды по методу Фолча.

Смеси упаривают досуха в токе аргона и растворяют каждую пробу в 3,0 мл метанола. Для измерения флюоресценции альфа-токоферола образцы разводят в 20 раз, берут микрошприцом из каждой пробы по 150 мкл и смешивают с 2,85 мл метанола. Измеряют интенсивность флюоресценцни, которая составляет: 16,5; 16,2; 16, 0; 16,0;

17,8 отн.ед., что соответствует содержанию альфа-токоферола 4,5; 4,4;.

4,3; 4,3; 4,8 мкr. Учитывая разведение образцов в 20 раз, получают суммарное количество альфа-токоферола в мембране 89,2+3,0 мкг, Для определения содержания альфатокоберола во внутреннем монослое бислойних везикул необходимо провес" ти окисление альба-токоферола, находящегося в наружном монослое. К пяти

1394 t 31 оставшимся параллельным образ цам, содержащим по 1,0 мл суспензия, добавляют мпкрошприцом ио 10 мкп ряствора Acppttl(tllttttдя калия до конечной концентрации " 10 И, перемешивают и через 4-5 мип проводят экстракцию липидов по методу Фолча. Смеси липидов упаривают досуха в токе яргAIIB и растворяют в 3,0 мп метанола. Получешгые образцы разводят в 20 раз, смешггвая 150 мкл образца с

2,85 мл метанола и излгеряют интенсивность флюоресценции альфа-ток оферола, которая составляет: 13, 2; 12, 8; 1?, 9;

12,4; 13,4 отн.ел, что соответствует содержанию альфа-токобероля 3, 6, 3,4; 3,5; 3,3; 3,6 мкг. Учитывая разведение образцов в 20 раз, получают содержание альфа-токоберопа во внутреннем монослое 69,6+ 2, 1 мкг, что составляет 78Е от суммарного содержания альАа-токоАероля в мембране, Такггм образом, в приготовленных бислойньгх липидш (х незикулах яльАа- 25 токофероля локализуется преимущественно во внутреннем монослое, что указывает ня его асимметричное распределение. Для определения содержания альба-токобероля в наружном мо- 30 нослое необходимо вычесть из суммарного количества альфа-токоферола его количество во внутреннем монослое: 89,2 — 69,6=19,6 мкг, что соответствует 227 от общего количества, 35

Пример 2. Берут !,0 мл раствора хлороформа, содержащего 10 мг фосфолипидов, упаривяют досуха в токе яргоня и добавляют 10 мл среды следующего состава: трис-НС1 (20 мИ), 4О !

1яС1 (100 мИ) рН 7,4, интенсивно встряхивают 3-5 мин. Полученную сус-. пензию подвергают ультразвуковой. обработке на УЗДН вЂ” 2 (режим работы: 22 кГц, воздействие ультразвука по

15 с в течение 10 мин при 0-4 С).

После ультразвуковой обработки суспензию цептрибугируют 20000 я, 20 мин.

Супернятянт представляет собой бислойные липидные везикулы, к которым добавляют этянольньпг раствор альбатокобероля Для этого к 10 мп супернятянтя, содержащего 5 мг фосАолипидов, добавляют 100 мкл раствора этянола, содержащего 1 мг альфа-токофероля. Смесь интенсивно перемешивают

5-10 мин. Затем определяют суммарное количество альфа-токоАерола в бислойшгх липидных везикулах. Берут нить It;I()BJIJIPJII IIIIIC проб по l, 0 мл и экстрягируют липиды tlo методу Фол 1а.

Смеси гигпидов упаривают досуха в токе яргона и растворяют в 3,0 мл метанола. Для измерения интенсивности флюорес(генции альфа-токоферола образцы разводят в 20 раз: берут из каждой пробы по 150 мкл,смешивают с 2,85 мл метанола и регистрируют интенсивность флюоресценции. Условия регистрации и калибровочная зависимость интенсивности флюорег.ценции от содержания альфа-токоберола рассмотрены и приведены в примере 1. После измерения получаем следуюггие значения интенсивности Алюоресценции: 18,5; 18, 1 17,8;

17,8; 17,4 отн.ед., что соответствует содержаш(ю альба-токоферола 5,0; 4,9

4,8; 4,8; 4,7 мкг. Учитывая разведение образцов в 20 ряз получают суммарное количество альАа-токоберола

97,2+1,4 мкг.

Для определения содержания яльфятокофероля во внутреннем монослое берут остальные 5 мл суспензии бислойггь(х везикул, разделяют на пять параллельных проб и к каждой пробе добавляют по 10 мкл феррицианида калия до конечной концентрации 2 .1О t1, перемешивают и через 4-5 мин проводят экстракцию липидов по методу Фолча.

Смеси липидов упаривают досуха в токе аргона, затем каждый образец растворяют в 3,0 мл метанола и регистрируют интенсивность Алюоресценции.

Наблюдают отсутствие флюоресценции вследствие полного окисления альфатокоберола. Следовательно, при включении альба-токоАерола в бислойные липидные везикулы альфа-токоферол распределяется асимметрично и локализован исключительно в наружном монослое.

Пример 3. Определение содержания яльАа-токоАерола в наружном и внутреннем монослоях плазматических мембран синаптосом мозга крысы. Плазматические мембраны синаптосом мозга гомогенизируют в гомогенизаторе стекло-тефлон в 10,0 мл среды следующего состава,.трис-НС1 (40 мИ), ИаС1 (100 мИ), рН 7,4. В суспензии мембран с концентрацией белка 1 мг/мл определяют суммарное количество альфатокоферола. Для этого берут пять параллельных проб, содержащих по

1,0 мл суспензии, и экстрягируют липиды по методу Фолча. Смесь липидов

1394131 йем ионослое плазматических мембран синаптосом мозга соответствует величине 6,0+0,3 мкг, что составляет 70Я от суммарного содержания альфа-токо" ферола в мембране.

Таким образом, в плаэматических мембранах сииаптосом мозга крысы альфа-токоферол локализован преимущественно во внутреннем монослое, что указывает на асимметричное его распределение в мембране. Для определения содержания альфа-токоферола в наружном монослое необходимо вычесть из суммарного количества альфа-токоферола его количество во внутреннем монослое: 8,6-6,0=2,6 мкг, что соответствует 307 от общего количества, Формула из обретения

Составитель Н, Гуляева

ТехредМ.Моргентал Корректор Л. Зимокосов

Редактор Г. Волкова

Заказ 2215/41 Тираж 847

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул, Проектная, 4 упаривают досуха в токе аргона и ! растворяют каждую пробу в 3,0 мл метанола. Для измерения интенсивности юоресценцип альфа-токоферола образ„5 цы разводят в 2 раза: берут из каждой пробы по 1,5 мл и смешиЬают с 1,5 мл метанола. Условия регистрации интенсивности флюоресценции и зависимость

:калибровочной кривой интенсивности 10 флюоресценции от содержания альфатокоферола рассмотрены и приведены в примере 1. Измеряют интенсивность юоресценции, получают 15,9 16,3, 15,2 15, 1; 16,5 отн.ед,, что соот ветствует содержанию альфа-токоферо па 4,3; 4,4, 4,1, 4,1, 4,5 мкг, учитывая разведение в 2 раза получают суммарное количество альфа-токоферора в мембране 8,6+О;3 мкг. 20 !

Для определения содержания альфатокоферола во внутреннем монослое ! ,.:плазматических мембран синаптосом ! необходимо провести окисление альфа токоферола, находящегося в наружном 25 .,монослое. К пяти параллельным образ—

:цам, содержащим по 1,0 мл суспензии

:мембран, добавляют по 10 мкл ферри:цианида калия до конечной концентра,ции 2 10 М. Перемешивают и через 30

4-5 мин проводят экстракцию липидов

:,по методу Фолча, смеси.липидов упа-! ривают досуха в токе аргона и затем

".растворяют в 3,0 мл метанола. В при:готовленных образцах регистрируют

35 флюоресцепцию альфа-токоферола иа спектрофлюориметре. Получают значения интенсивности 22,6; 21,7) 23,5, 21,8;

21,5 отн.ед., что соответствует со держанию альфа- токоферола 6, 1; 5,9; 40

6,3 5 9 .5 8 мкг, таким образом содержание альфа-токоферола во внутренСпособ определения альфа-токоферола в бислойных липидных мембранах путем экстракции липидорастворимых соединепий исследуемых мембран с последующим флюориметрическим анализом экстракта, отличающийся тем, что, с целью раздельного определения альфа-токоферола в наружном и внутреннем монослоях, в одной части исследуемой пробы определяют суммарное количество альфа-токоферола, другую часть обрабатывают феррицианидом калия, затем экстрагируют липиды и по интенсивности флюоресценции экстракта определяют содержание альAR-òoêîôåðîëà во внутреннем монослое, а содержание альфа-токоферола в наружном монослое определяют как разность между общим содержанием альфатокоферола и его содержанием во внутреннем монослое.