Способ получения динуклеотидов

 

Изобретение относится к способу получения динуклеотидов общей формулы носв O.R О ОЯ А-сн, о он 0-Р-ОН «« где R - остаток азотистого основания нуклеиновой кислоты; цитозин, урацил, аденин, гуанин. С целью повышения выхода целевого продукта осуществляют твердофазный, катализируемый этилендиамином синтез, включающий растворение в водном растворе этилендиамина соответствующего нуклеозид-2 ,3 -циклофосфата, лиофилизацию зтого раствора, инкубацию нагретой до 40-70°С массы в течение 1- 2ч. Проинкубированную реакционную массу растворяют в воде и повторяют диофилизацию и инкубацию нагретой сухой реакционной массы в 2,6 раз. После зтого выделяют продукт. 2 з.п. ф-лы. I Nj; сд ю

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК е (gg 4 С 07 Н 21/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯц:К АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

О Oli

О Р- ОК

d-сн, О ОН..

0 Р-ОИ

ОИ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3546118/23-04 (22) 27.01.83 .(46) 23.06.88. Бюл. У 23 (71) Институт биологической физики

АН СССР (72) Б.И.Сухоруков и Н.М.Гусенкова (53) 547 .963 .3+542.9)(088 .8) (56) David А. Dixon et al, Sintes of

the Anticodon Loop of Escherichia

co1i Methionine Transter Ribonucleic

Acid..- I. am. Chem. Soc., v. 96, У 7, (1974), р. 2205-2296.

Ming L. Sung, Saran N. Narang.

Modified phosphotriester method for

chemical Synthesis of ribooligonucleoti!des.- Can. Z. Chem., v. 60, р. 111-119, 1982.

Гусенкова Н.М. и Сухоруков Б.И.

Твердофазный, катализируемый аминами синтез олигонуклеотидов. — Журнал органической химии, 1976, т. 46, вып. 4, с. 939.

„,З0„„14 4 12 Al (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИНУКЛЕОТИДОВ (57) Изобретение относится к способу получения динуклеотидов общей формулы яосн где R — остаток азотистого основания нуклеиновой кислотьц цитозин, урацил, аденин, гуанин. С целью повьппения выхода целевого продукта осуществляют твердофазный, катализируемый этилендиамином синтез, включающий растворение в водном растворе этилендиамина соответствующего нуклеозид-2,3 -циклофосфата, лиофилизацию этого раствора, инкубацию нагретой до 40-70 С массы в течение 12 ч. Проинкубированную реакционную массу растворяют в воде и повторяют лиофилизацию и инкубацию нагретой сухой реакционной массы в 2,6 раз.

После этого выделяют продукт.

2 з.п. ф-лы.

)404512

Изобретение относится к способу получения динуклеотидов общей формулы носн

О OH

О Р-ОН

О-Сн

ОР-ОН

)5 где R — - остаток азотистого основания нуклеиновой.кислоты: цитоэин, урацил, аденин, гуанин, которые используют 20 как исходные вещества при синтезе более высокомолекулярных олигонуклеотидов и нуклеиновых кислот в исследовательских целях и как лекарственные препараты в медицине.

Цель изобретения - повьппение вы) хода целевого продукта, 30

Пример 1. 4,55 r (12 мкмоль)

С р растворяют в 0,05 мл (50 мкмоль)

1 М водного раствора этилендиамина (рН = 7,8). Лиофилизуют в вакууме при о

10 мм рт.ст,, нагревают до 40 С и выдерживают при этой температуре реакционную массу в течение 1 ч, Затем цикл растворения (добавление 0,05 мл воды и перемешивание), лиофилизации, о нагревании до 40 С и выдерживания при 40 этой температуре в течение 1 ч повторяют 4 раза, Для выделения целевого продукта в реакционную массу добавляют 0,05 мл воды и переносят раствор на хроматографическую бумагу ватман 45

3 мм, осуществляют нисходящее хроматографирование в системе А; изопро панол-аммиак-вода (7:1:2 по объему).

Полосы с определенным R (А), соответствующие полученным веществам, вырезают. R (A) — адсорбционная подвижность продуктов реакции относительно

Ср в хроматографической системе А.

Полученные вещества с хроматографической бумаги элюируют смесью спирт— вода (7:3 по объему). Растворитель

55 отгоняют в вакууме и получают Ср Ср в чистом виде. Структуру полученного целевого продукта доказывают ферментативным гидролизом с панкреатической рибонуклеазой по известному методу, а также данными спектрофотометрического анализа.

Выход Ср Ср при четырех одночасовых циклах составляет 13,0Х При таком же суммарном времени выдерживания в нециклическом режиме по известному способу выход 5, 7X, R<(A) < cp

=0,41; У -спектр: Ъмакс =280 нм, Ъ ми и =240 HM °

Пример 2. 4 55 мг () 2 мкмоль)

V + р растворяют в 0,05 мл (50 мкмоль)

1 M водного раствора этилендиамина (рН 7,8). Лиофилизуют в вакууме при

10 мм рт.ст., нагревают до 70 С и выдерживают при этой температуре реакционную массу в течение 2 ч. Затем цикл растворения (добавление 0 05 мл воды и перемешивание), лиофилизации, нагревания и выдерживания в течение

2 ч повторяют 3 раза. Целевой продукт UpU 1 выделяют аналогично примеру 1. Выход UpУа при трех, — двухчасовых циклах и, соответственно, при суммарном времени выдерживания реакционной смеси 6 ч составляет 14,477 (0,39 мг). При этом же времени выдерживания в нециклическом режиме выход

4 8Е R<(A)oтн 0 =0 43; УФ-спектр:

Пример 3. 4,85 мг (12 мкмоль)

А> р растворяют в 0,05 мл (50 мкмоль) ! M водного раствора этилендиамина (рН 7,8), лиофилизуют в вакууме при

10 мм рт.ст., нагревают до 50 С и выдерживают при этой температуре реакционную массу в течение 1 ч. Затем цикл растворения (добавление 0,05 мл воды и перемешивание), лиофилизации, нагревания и выдерживания в течение

1 ч повторяют 2 раза, Целевой продукт Ар Ар выделяют аналогично примеру 1, Выход Ар Ар при двух одночасовых циклах и, соответственно, при суммарном времени выдерживания

2 ч составляет 8,29Х (0,24 мг). При этом же времени вьщерживания в нециклическом режиме выход — 5, 15%.

R g (A) отн. д =О, 4; УФ-спектр . % макс

=257 нм, 9, мин =230 нм.

Пример 4. 4,55 мг (14 мкмоль)

I з растворяют в 0,2 мл (200 мкмоль)

1 M водного раствора этилендиамина (рН 7,8), лиофилизуют в вакууме при

10 мм рт.ст,, нагревают до 50 С и выдерживают при этои температуре реакционную массу в течение 1 ч.

25 а он

0 Р-GH оа

Составитель Т ° Шмелева

Техред М.Ходанич Корректор M. Максимищинец

Редактор Н. Яцола

Заказ 3056/26

Тираж 348 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5. Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4.

Затем цикл растворения. (добавление

0,05 мл.воды и перемешивание) лиофилизации, нагревания и выдерживания в течение 1 ч повторяют 3 раза, Вы5 ход Ip Ip при трех одночасовых циклах и, соответственно, при суммарном выдерживании 3 ч составляет

5,83 (0,15 мг). При этом же времени выдерживания в нециклическом режиме выход 4,09 . К (А)о,„ц =0,38; УФспектр: макс м мин =228 нм.

Структуру полученных динуклеотидов

Ар Ар и Ip Ip доказывают известным ферментативным гидролизом с рибонуклеазой P brevicompaceum.

Как следует из приведенных примеров, предлагаемый способ позволяет в 2-3 раза повысить выход целевого продукта. -20

Формула из обретения

1. Способ получения динуклеотидов общей формулы

12 где R — остаток азотистого основания нуклеиновой кислоты, выбранный иэ цитоэина, урацила, аденина, гуанина, путем твердофаэного, катализируемого этилендиамином синтеза, включающего растворение в водном растворе этилендиамина соответствующего нуклеозид-2,3 -циклофосфата, лио-! ( филиэацию этого раствора, ннкубацию нагретой сухой реакционной массы и выделение целевого продукта, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, проинкубированную реакционную массу растворяют в воде и подвергают повторной лиофилизации и инкубации.

2. Споооб по и. 1, о т л и ч аю щ н и с я тем, что инкубацию сухой реакционной массы проводят при 4070 С в течение 1-2 ч.

Г

3. Способ по п. 1, о т л и ч а " ю шийся тем, что растворение в воде, лиофилизацию и инкубацию нагретой сухой реакционной массы повторяют 2 — 6 раз.