Способ серологической диагностики алеутской болезни норок

 

Изобретение относится к ветеринарии , а точнее к ветеринарной вирусологии . Целью изобретения является повышение чувствительности способа. Для осуществления способа антиген, содержащий инактивированный вирус алеутской болезни норок, предварительно концентрнругот, проньшают буфером , повторно концентрируют ультра-фильтрацией и иодируют изотопом с помощью NaJ в присутствии хлорамина Т и метабисульфата натрия.. После добавления указанного антигена к исследуемой сьюоротке указанную смесь инкубируют-в течение 1-1,5 ч, отделяют, осадок цеитрифугированием и измеряют его радиоактивность, которая и служит мерой содержания . антител в исследуемой сыворотке. 2 табл. с

СООЗ СОВЕТСНИХ

СаежЛИСТИЧЕСНИХ

РЖСПУБЛИН!

19! ИИ (51) 5 А 61 К 39/00

МТенТВ- l

ГИБЛ .

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (46) 15.09.90.Бюл. Ф 34 (21) 4039680/30-13 (22) 18.03.86 (71) Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного научного центра АН СССР и Дальневосточный трест звероводческой промышленности "Дальэвер(.- яром" (72) А.М.Люцко, А;И.Ковалевская, В.П.Влаэнев, Н.Ф.Кальницкий, Г,А.Набережных, Р.И.Гришин и В.А.Фоминых (53) 616"078 (088.8) (56) Наставление по применению набора антигена и контрольных сывороток в реакции иммуноэлектроосмофо- реза для серологической диагностики алеутской болезни норок У 115-6a от 4еО7 ° 80ь Иеу Иинсельхоэ СССР, Главное управление ветеринарии, 5 с. (54) СПОСОБ СЕРОЛОГИЧЕСКОИ ДИАГНОСТИКИ АЛЕУТСКО1! БОЛЕЗНИ НОРОК (57) Изобретение относится к ветеринарии, а точнее к ветеринарной вирусологии. Целью изобретения является повьппение чувствительности способа.

Для осуществления способа антнген, содержащий инактивированный вирус алеутской болезни норок, предварительно концентрируют, промывают буфером, повторно концентрируют ультрафильтрацией и иодирувт изотопом J с помощью NaJ" в присутствии .хлорамина Т и метабисульфата натрия..

После добавления укаэанного антнгеиа к исследуемой сыворотке указанную смесь инкубируют -в течение 1-!,5 ч, отделяют. осадок центрифугированием и измеряют его радиоактивность, которая и служит мерой содержания антител в.исследуемой сыворотке. . 2 табл.

1427651

Изобретение относится к ветеринарии, а точнее к ветеринарной вирусологии.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу диагностики ,алеутской болезни норок, включающему реакцию преципитации комплекса анти- !О ген-антитело, сыворотку крови животного смешивают с нзвестныи количествои штамиа П-1 вируса алеутской болезни, который предварительно концентрируют ультрафильтрацией, промы- !5 вают буферои, повторно концентрируют ультрафильтрацней, ноднруют изотопои J известным методом.

П р и и е р 1. Анализируемые пробы сыворотки крови животных растворя- 20 ют в буферном растворе с рН 7,4-7 5 добавляют известное количествоштамма

П-1 вируса алеутской болезни, который предварительно концентрируют ультрафильтрацией до 0,1 первоначаль- 25 пого объема, затем разбавляют восьмикратным избытком фосфатного буфера с рН 7,0, снова концентрируют полученную суспензию ультрафильтрацией в 8 раз и далее иодируют известным 30 способои с помощью Na - J a присутствии хлорамнна Т и метабисульфата натрия. Процесс проводят в течение

20 инн прн О С прн переиешивании.

Полученный меченый радиоактивным ио35

räîè нрепарат,вируса очищают от несвязавшегося радиоактивного иода гельфильтрацней на колонке с сефадексом

0-50. Смесь сыворотки с иодированным штаммом П-1 вируса алеутской болезни А0 ннкубируют в течение 1 ч при 18 С, вносят раствор полизтнленгликоля для осаждения образовавшегося комплекса антиген-антитело,.осадок отделлют центрифугированиеи и радиоактивность, 15 служащую мерой содержания антител, считают на автоматическои счетчике.

Заключение о состоянии животного делают на основании сравнения результатов контрольных и анализируеиых проб. 0

Как следует. нэ вышеизложенного, для осуществления предлагаеиого способа диагностики алеутской болезни норок штамм Н-1 необходимо предварительно подвергнуть концентрированию

55 ультрафильтрацией, . промывке буферои, повторному концентрированию ультрафильтрацией.

Последующее иоднрование штамма

П"1, подвергшегося такой обработке, приводит к получению штамма П-! с. высокой удельной радиоактивностью, который при иикубацни с сывороткой крови способен давать иммунологический комплекс, обнаружнваеиый по радиоактивности.

Удельная радиоактивность иодированного штамма П-1 составляет 33,5

ГБК на; 1 г белка, объеиная активность 4,02 ГБК/л, массовая концентрация 0,12 г белка/л, степень коди- рования близка к единице;

При этом показано, что иодирование штамма П-) без предварительного концентрированнл ультрафильтрацией, промывки буфевом, повторного концентрирования не приводит к включешпа радиоактивного иода в антиген. .Иодированный вирус сохраняет антигенные свойства исходного препарата, что показано методами нммуноэлектроосиофореза и радиоиммунопреципитации.

Степень связывания со специфическими антнтелами составляет приблизительно.

707. Он не обладает инфефкционностью, что особенно ценно при работе с такии опасным возбудителем, каким является характернзу ощийсл множественностью путей распределения распространения вирус алеутской болезни, устойчивый к воздействию ряда химических реществ, температуре и колебаниям рП, к прогреванию при 56вС и действию ферментов.

Пример 2. 2 мл антигена, выпускаемого биопромышленностью для серологической диагностики алеутской болезни норок, представляющего собой стерильный, не обладающий инфекционностью штамм П-1 вируса алеутской болезни норок, помещают в установку для ультрафильтрации и фильтруют через меибрану "Рипор". МВ-1 с диаметром пор 100-150 A (г. Олайне), уиеньшая первоначальный объем до

0,4 ил. Затем добавляют 4 ил фосфатного буфера (0,1 М натрий-фосфатный буферный раствор с рН 7,0) и снова концентрируют ультрафильтрацией до

0,4 мл.

Смешивают подготовленный аптиген с 80 МКБ " JNa (без носителл, иолярная активность 62000 ТБК/моль), растворенного в 0,1 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера, и 0,1 мл свежеприготовленного раствора хлорамина Т

27бГ) 5

)О

30

3 l4 (2 иг/мл в 0,05 И фосфатнои буфере с рН 7 0). Инкубируют 20 мин пфи

0 С .при перемешивании. Добавляют

0,4 мл раствора метабисульфата натрия (2,4 иг/мл в 0,05 И фосфатнои буфере), затеи О,I ил 0,1 И раствора

К) в 0,1 И фосфатиои буфере. Вносят смесь в колонку размером ) 40 см с сефндексои G-50 и злюируют эабуференным физиологическим раствором (0,9Х-ный ))аС1). Проводят непрерывную регистрацию содержания белка в элюате с помощью проточной УФ-абсорб цйонной кюветы. Собирают фракции объемои ил и измеряют в них радиоактивность на -счетчике. Гель-фильт рация позволяет полностью отделить меченый антиген от ниэкомолекулярных радиоактивных прячесей. При отсутствии проточного спектрофотометра, фракции, содержащие антиген, можно определить визуально, так как они имеют отчетливый желтый цвет. Их объединяют, раэба;-ляют физиологическим раствором, содержащим 1 мг/мл бычьего сывороточного альбуиина, до уровня счета аликноты объемом

5 мкл примерно I 106 имп./иин и хранят при 4-8 С.

В пробирки (пластиковые или стеклянные) вносят по 300 икл фосфатного буферного раствора с рН 7,4, имеющего следующий состав. Ка НР04i 2Н О .

)О,б г; натриеная соль этилендиаиинтетрауксусной кислоты 2Н О 3,73 г;, бычий сынороточный альбуиии ) F вода дистиллированная до 1 л.

Кровь норок, отобранную для исследования в стеклянные стандартные капилляры () х 70 ми), центрифугируют при 1500-3000 об/мин в течение

5 мин, отламывают часть капилляра с сывороткой и осторожно ныдувают содержимое при помощи специальной гру ши или резиновой трубки в пробирки с подготовленныи фосфатным буфером.

Объемы вносимых для иссяедования сывороток в данном эксперименте составдяли 20 икл. Одновременно для контроля реакции готовятся серии проб, содержание! 1) 20 мкл стандартной сыворотки здорового животного. (êoíòðoëü неспецефического связывания); 2) 20 мкл стандартной сыво-. ротки больного животного (контроль специфического связывания); 3)

20 мкл буферного раствора (контроль радиоактивности). Для получения достонерных результатон желательно нсе пробы дублировать, Далее н пробирки с пробами добавляют по 200 мкл меченого ) штаима П-! алеутской болезни (активность 1340 Бк). Предварительно подбирают разведение меченого аитигена, обеспечивающее полное. связывание антител н пробах в иммунные комплексы. В данном случае счет вносимой аликвоты составлял

60000 имп./иин.

Пробирки после переиешинання содержимого оставляют íà 1,5 ч при комнатной температуре, затем н каждую добавляют no I мл 207.-ного растнора полизтиленгликоля (мол.м бООО) для осаждения иммунного комплекса,. встряхивают и цептрнфугируют 15 мин при

3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, пробирки переворачивают и помещают отверстиями вниз на сложенную в несколько слоев фильтрованную бумагу для наиболее полного удаления жидкости. Радиоактивность осадков считают на автоматическом -счетчике.

Результаты типичного опыта представлены в табл.).

На примере анализа крови 30 жина1ных показаны различия между тяжело больными жинотныии, здоровыми и теин, у которых счет радиоактивности, отражающий содержание антител н крови, имеет промежуточные значения.

Одновременное определение тех же образцов по РИЭОФ покаэало, что положительную реакцию дают только животные с тяжелой .формой заболевания, т.е. имеющие высокий титр антител.

В группе животных с ранними формамн заболевания по прошествии месяца с момента обследования были зарегистрированы случаи заболевания, дающие положительную реакцию на РИЭОФ..

Эти наблюдения позволяют считать, что предлагаемый способ можно испольэовать для ранней диагностики алеутской болезни.

Параллельное обследование И44 норок из зараженного стада обоими способами показало, что ныявляемость тяжелых форм заболевания в 3,5 раза, а всЕх форм с повышенным содержанием антител в 40 раэ выше по предлагаеиоиу способу, чем по РИЭОФ (табл.2).

Таблиц а

Результаты исследования образцов крови порок.Счет радиоактивности, имп./мин

Исследуемые пробы

Контроль радиоактивностии

Контрольная сывоКонтрольная сыво ротка здорового животного ротка больного животного 4300 4250 26300 4050 29500 17500

4400 28600

4300 25900

16600

13050

5500

4900 24900

4500 23900

4450 23800

10200

9600

4600 22900

8000

8700

4600 22200

3800 20800

3500 20600

7500

6800

Счет радноактнпностй производился на g-счетчике "Гамма-Трэк" " 1191 с автоматической сменой проб, минимальным временем счета 10 с и выводом информации в стандартизованном виде: Рахим образом, предложенный способ позволяет проводить раннюю диаг1 ностику алеутской болезни, снизить расход антнгена и автоматизировать процесс.

Расход меченого антигена на одно определение составляет 4 ° 10 " г (по содержанию белка). Иэ стандартной дозы выпускаемого биопромышленностью антигена, рассчитйшой на 2500 определений по реакции иммуноэлектроосмофореэа, можно получить меченый иодом антиген на 30000 определений по предлагаемому способу.

27651 6

Формула изобретения

Способ серологнческой диагностики алеутской болезни норок, включающий отбор крови у животных, получение нэ нее сыворотки с последующими постановкой реакции между сывороткой н ацтнгеном и анализом результатов, о т" л и ч а ю щ н и с я тем, что, 10 с целью повышения чувствительности способа, антиген перед постановкой реакции концентрируют до О, 1-.0,2 первоначального объема, затем разбавляют в 8-10 раз фосфатным буфером

15 с рН 7,0, после чего повторно концентрируют ультрафильтрацией в 8-10 раэ н иоднру т изотопом 1(9 для

) ° проведения реакции смесь антигена и сыворотки инкубируют в течение

20 1,5 ч, затем осаждают, а анализ результатов осуществляют по радиоактивности полученного осадка.

Здоровые Больные Ранние форживотные животные мы заболевания. 1427651 8

Таблица 2

Сравнительное изучение диагностической ценности способов

Ю

Способ Количество обследованных животных

Состояние животных тяжело ранние формы больные заболевания

248

Предлагаемый"

1144

Прототип . (РИЭОФ) 19

1144

Составитель.С.Светлывев.Редактор Л.Павлова Техред Д.Сердюкова Корректор А Обручар .

Заказ 3325 Тираж 547 . . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, 11осква, Ж-35 Раувская наб., д. 4/5

«ю

Производственно-полиграфическое предприятие .г, Ужгород, ул. Проектная, 4