Способ получения антигена из внешней мембраны бактериальных клеток

 

Изобретение относится к микробиологии, касается способов выделения белков из микробной массы, предназначено для диагностики псевдотуберкулезной инфекции и защиты от нее организма. Цель изобретения - повышение степени очистки белка порина из псевдотуберкулезного микроба и упрощение способа. Для этого суспензию микробных клеток с добавленными стеклянными бусами (⊘ 1 - 1,5 мм) центрифугируют 45 мин при 600 g, осадок суспендируют в 0,03 М трис-HCl буфере, pH 7,2 (буфер А), содержащем 2% тритона Х-100, и экстрагируют при 4°С 2 ч, интенсивно перемешивая. Осадок отделяют центрифугированием при 20000 g 15 мин, промывают буфером А, суспендируют в 200 мл буфера, добавляют 1М раствор MgCl₂ и ДНК-азу и инкубируют 12 ч. Осадок отделяют центрифугированием при 20000 g 30 мин, промывают буфером А, суспендируют в буфере А, содержащем 2% додецилсульфата натрия, и 15 мин экстрагируют при 60°С. Комплекс пептидогликан-белок отделяют центрифугированием при 45000 g 1 ч. Осадок промывают, суспендируют в 100 мл буфера А, содержащего 0,5% додецилсульфата натрия и 0,5 М NaCl, осадок отделяют центрифугированием при 100000 g 30 мин, суспендируют в 50 мл буфера А, осадок отделяют центрифугированием при 150000 g 1 ч. Белок осаждают из суспернатанта 9,5 объемами холодного ацетона, выдерживают при 2 - 10°С 12 ч. Отделяют осадок, суспендируют в дистиллированной воде, лиофилизуют. Выход продукта 3,5%. Низкомолекулярные белки в нем отсутствуют.

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам выделения белков из микробной массы, и может быть использовано для диагностики и защиты организма от псевдотуберкулезной инфекции. Целью изобретения является повышение степени очистки белка порина из псевдотуберкулезного микроба и упрощение способа. П р и м е р 1. 20 г микробных клеток суспендируют в 2 л физиологического раствора, охлажденного до 4^оС, добавляют 75 мл стеклянных бус диаметром 1-1,5 мм и встряхивают на механической трясучке в течение 2 ч. Суспензию центрифугируют в течение 45 мин при 600 g. Осадок суспендируют в 200 мл 0,03 М трис-НСl буфера, рН 7,2 (буфер А), содержащего 2% тритона Х 100, и экстрагируют при 4^оС в течение 2 ч при интенсивном перемешивании. Осадок отделяют центрифугированием при 20000 g в течение 15 мин, промывают буфером А, суспендируют в 200 мл буфера, добавляют 2 мл 1 М раствора MgCl₂ и 10 мг ДНК-азы (реахим НПО "Биохимреактив" ОЗХР) и инкубируют 12 ч. Осадок отделяют центрифугированием при 20000 g в течение 30 мин, промывают буфером А, суспендируют в 150 мл буфера А, содержащего 2% додецилсульфата натрия, и экстрагируют при 60^оС в течение 15 мин. Комплекс пептидогликан - белок отделяют центрифугированием при 45000 g в течение 1 ч. Осадок промывают водой, суспендируют его в 100 мл буфера А, содержащего 0,5% додецилсульфата натрия и 0,5 М NaCl, выдерживают при 37^оС в течение 30 мин. Осадок отделяют центрифугированием при 100000 g в течение 30 мин. Суспендируют его в 50 мл буфера А, содержащего 2% додецилсульфата натрия, и кипятят на водяной бане 10 мин. Осадок отделяют центрифугированием при 150000 g в течение 1 ч. Белок осаждают из супернатанта 9,5 объемами холодного ацетона (5^оС) и выдерживают при 2-10^оС 12 ч. Отделяют осадок, промывают холодным ацетоном, дистиллированной водой, суспендируют в дистиллированной воде и лиофилизуют. Выход продукта 3,5% (по отношению к исходной микробной массе). Содержание белка и моносахарида 78,2 и 3,3% (соответственно). Низкомолекулярные белки отсутствуют. П р и м е р 2. Условия осуществления этого примера те же, за исключением условий проведения первой стадии диссоциации комплекса пентидогликан - белок. Осадок суспендируют в 100 мл буфера А, содержащего 1% додецилсульфата натрия и 0,5 М NaCl, и выдерживают при 40^оС 45 мин. Выход продукта 3,4% . Содержание белка то же, что в примере 1, т.е. 78,2% , содержание моносахаридов не превышает 3%. Низкомолекулярные белки отсутствуют. Проведение диссоциации комплекса при более высоких значениях температуры и концентрации додецилсульфата натрия, а также увеличение времени диссоциации комплекса с целью повышения степени очистки белка приводят к потере целевого продукта. В сравнении со способом-прототипом предлагаемый способ позволяет получать продукт, обладающий более высокой степенью очистки. Сыворотки, получаемые при иммунизации животных препаратом, выделенным по способу-прототипу, не обладают специфичностью по отношению к белку, так как содержат значительные количества антител к липополисахариду. Использование таких сывороток при постановке серологических реакций предполагает предварительное их истощение высокоочищенным липополисахаридом. Коммерческие препараты липополисахаридов достаточной степени очистки - дорогостоящие, а получение высокоочищенного препарата липополисахарида в лабораторных условиях - трудоемкий процесс. Липополисахарид является типоспецифическим антигеном грамотрицательных бактерий. С помощью сыворотки, получаемой к нему, можно идентифицировать только определенный серотип микроорганизма. Порин, выделяемый по предлагаемому способу, обладающий высокой степенью очистки, как видоспецифический антиген может быть использован для индикации всех серовариантов псевдотуберкулезного микроба. Предлагаемый способ не требует специального оборудования (термостатированные колонки, дезинтегратора). Целевой продукт в предлагаемом способе содержит меньше примесей, чем таковой в прототипе: моносахаридов 3 и 19,1% соответственно и не содержит низкомолекулярных белков, в то время как в целевом продукте по способу-прототипу они присутствуют. Предлагаемый способ проще в исполнении, так как не требует специального оборудования (термостатированных колонок, дезинтегратора).

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ИЗ ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК, включающий обработку бактериальных клеток для удаления капсулы, очистку от нуклеиновых кислот, экстракцию цитоплазматических белков 2%-ным раствором тритона Х 100, экстракцию комплекса пептидогликан - белок 2%-ным раствором додецилсульфата натрия при 60^oС, диссоциацию комплекса путем повторной обработки додецилсульфатом натрия при 100^oС, осаждение продукта и его лиофилизацию, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки порина из псевдотуберкулезного микроба и упрощения способа, экстракцию тритоном Х 100 проводят после снятия капсулы, а перед повторной обработкой 2%-ным раствором додецилсульфата натрия осуществляют обработку 0,5 - 1,0%-ным раствором додецилсульфата натрия при 37 - 40^oС в течение 35 - 40 мин.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 11-2002

Извещение опубликовано: 20.04.2002        

---