Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к рекомбинантному интерлейкину-2 человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки и определения интерлейкина . Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животньк Mus. musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к рекомбинантному интерлейкину-2 (РИЛ-2) человека повышенной специфичности. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии BALB/C, иммунизированных РИЛ-2 человека , с клетками миеломы X63-Ag 8-653. Продукция MICA на 2-3 день культивирования составляет 20-22 мкг/мл культуральной среды и 10-12 мг/мл асцитической жидкости. МКА относятся к классу IgGj они специфически взаимодействуют как с мономером РИЛ-2, так и 3 с его мультимерами. Продукция МКА сохраняется как минимум до 10 пассажей in vitro. (Л с

СО)ОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) 3 А1 (я)4 C12N500

)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К A ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4228376/28-13 (22) 13 ° 04. 87 (46) 15. 11.88. Бюл. Р 42 (71) Белорусский научно-исследовательский институт переливания крови (72) А,B.Ïàí)oòè÷, Н.Н.Войтенок, А.Ю.Циманис, Ю.П.Бундулис и B.À.Ñêðèâåëèñ (53) 578.085.23(088.8) (56) Патент США - 4473493, кл. С 07 G 7/00, 1984, (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS ГБ$С(Л.1)8, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ

АНТИТЕЛ К РЕКОМБИНАНТНОМУ ИНТЕРЛЕЙКИНУ-2 ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки и определения интерлейкина. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Мцз. musculus, продуцирующего моноклональные антитела (MKA) к рекомбинантному интерлейкину-2 (РИЛ-2) человека повышенной специфичности. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мьппей линии BA1.B/с, иммунизированных РИЛ-2 человека, с клетками миеломы Х63-Ag 8-653.

Продукция МКА на 2-3 день культивирования составляет 20-22 мкг/мл культуральной среды и 10-12 мг/мл асцитической жидкости. МКА относятся к классу IgG< они специфически взаимодействуют как с мономером РИЛ"2, так и ф с его мультимерами. Продукция МКА сохраняется как минимум до 10 пассажей и vitro. С::

1437393

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки и определения интерлейкина.

Цель изобретения — получение штам5 ма гибридных культивируемых клеток животных Nus, musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) и рекомбинантному интерлейкину-,2 (PNII-2) человека повышенной специфичности.. 10

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии ВА1.В/с, иммунизируют внутрибрюшинным введением 1500 ЕД

РИЛ-2 человека в 0,15 мл 0,15 M NaC1 в смеси с равным объемом полного адью-15 ванта Фрейнда., Иммунизации повторяют

3 раза через 14 дней тем же количеством антигена в смеси с неполным адьюнантом Фрейнда. За 3 дня до слияния

РИЛ-2 вводят внутрибрюши но в 0„5 мл 20

О, l5 М ИаCI. Гибридизацию 1 i0 клеток селезенки иммунных мьппей и 3 10 клеток миеломы мьшы Х63-Ag8-653 проводят 507-пым раствором полиэтиленгликоля мол. массы 4000„ содержащего 25

5% диметилсульфоксида, в течение

1,5 мин. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля клетки высевают в 96-луночные панели по

1 ° 10 спленоцитов в лунку. Для куль- 30 тивирования и селекции гибридом используют среду 11ggl (модифицированная Iskove"s среда Дульбекко) с добавлением 107 эмбриональной телячьей сыворотки (З С), 10 М гипоксантина, 4 10 М аминоптерина и 1,6-10 N тимидина. Гибриды-продуценты клонируют 2. раза методом конечных разведений, высевая по 1 клетке в лунку,„ содержащую 4 .10 клеток "åëåçåíêè. gp ф

После двух клонирований практически

100% субклонов продуцируют МКА к

РИЛ-2 человека. Полученный штамм обоз" качают 1ЗБ1.2. Он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института Цитологии АН СССР под номером

BCKI((ХХ) 108D и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки, 50

Стандартные условия культивирования — среда ПЩМ с 107 донорской телячьей сыворотки, 2 мМ 1.-глутамина, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05 мМ меркаптоэтакола, при 37 С и в атмосфере 5 СО .

Для выращивания штамма используют стеклянную посуду, посевная доза

200 тыс. клеток на миллилитр, клетки пассируют один раз в 2-3 дня, кратность рассева 1:6-1:8. Культура суспензионная.

Культивирование в организме животных. Для выращивания асцита пригодны . мыши BALB/с. Мьппам за 7-30 дней до инъекции клеток штамма вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Клетки инъекцируют внутрибрюшинно по 2 - 5x

6 х 10 клеток в 1 мл среды ЩДМ, Асцит формируется через 12-14 дней.

Продуктивность штамма. Секреция моноклональных антител на 2-3 день культивирования составляет 20—

22 мкг/мл культуральной среды и l0

12 мг в 1 мл асцитной жидкости при определении иммуноферментным методом.

Характеристика полезного продукта

МКА относится к классу IgG . Они спе s цифически взаимодействуют как с мономером РИЛ-2, так и с его мультимерами. Продукция МКА сохраняется как минимум до 10 пассажей in vitro в асцитной форме штамм не пассируется более одного раза.

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплаэмой не выявлено при окрашивании красителями на ДК Н и по характеру включения тимидиновой метки.

Криоконсервирование. Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением l07 диметилсульфоксида. Режим эаморажния: 1 С/мин

0 до -70 С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание — на водяной бане при 37 С.

Жизнеспособность клеток после размораживания 70-807. по окрашиванию трипановым синим.

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Гибридомные клетки помещают в стеклянный флакон объемом

50 мл до 1 10 клеток в 5 мл среды

1МДМ с 107 ЗТС, 2 мМ 1-глютамина, 1О0 мкг/мл пенициллина и стрептомициnа, 0,05 мМ меркаптоэтанола. Клетки культивируют 2-3 дня при 37 С в атмосфере 57. СО . Полученный супернатант используют в качестве реагента в иммунохимических реакциях (как препарат NKA).

Антигены высушивают в лунках 96о. ячеечных микроплат при 37 С или 20 С

7393

4 (НЦ) с диаметром пор 0,45 мкм проводят в течение 1 ч. После переноса НЦ

Культуральная среда штамма 1.3Б1.2 (A492,10э )

2363

Антигены

50

Тираж 520 Подписное г. Ужгород, ул. Проектная, 4

143 в следующих количествах: РИЛ-2 50 нг в 20 мкл бидистиллированной воды; мембранная фракция Е.coli, растворимые белки Е.coli и бычий сывороточный альбумин (БСА) — по 1 мкг в 20 мкл бидистиллированной воды. После отмывок в ячейки вносят по 50 мкл культуральной среды полученного штамма. Панель инкубируют 2 ч при 20 С, затем отмывают 5 раэ бидистиллированной водой и вносят по 50 мкг/лунку кроличьи противомышиные антитела, меченные пероксидазой, разведенные 1/2500 в

ЗФР-БСА (0,01 М фосфатный буфер, ph

7,4, 0,15 M NaC1, 1Х БСА). После инкубации в течение 1 ч при 20 С плату отмывают и в лунки добавляют "субстрат — ортофенилендиамин гидрохлорид, 0,6 мг/мл в цитратно-фосфатном буфере, рН 4,7, содержащем 0,03/ Н О

Реакцию останавливают через 10 мин

1 М серной кислотой и учитывают на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 492 нм.

Результаты исследований приведены ниже:

РИЛ-2

Растворимые белки

Е. col i 376

Мембранная фракция

Е,coli 429

БСА 206

Результаты свидетельствуют о высокой специфичности полученных МКА к РИЛ-2 человека (коммерческие препараты MKA имеют значение. А492 10 для РИЛ-2, равное 1517) .

Пример 2. Электрофорез в

157-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГЭ) проводят с использованием аппарата для вертикального электрофореза. РИЛ-2, 10 мкг, в буфере для образца в редуцирующих или нередуцирующих условиях и эквивалентное количество лизата Е.coli в буфере для образца в редуцирующих условиях прогревают 2 мин при 100 С и наносят в ячейки геля. Электрофорез осуществляют при постоянной силе тока 50 мА.

Электроперенос разделенных компонентов из геля на нитроцеллюлозу

ВНИ1ШИ Заказ 5855/25

Ilpolf3J3. (олигр. пр-тие, 5

30 промывают дистиллированной водой и далее обрабатывают с помощью набора для иммуноблотинга. Неспецифическую сорбцию белка на НЦ блокируют в

0,02 М НС1 рН 0,5 M

NaC1 (ТБР), содержащем ЗЕ желатины.

После этого НЦ промывают 2 раза ТБР с 0,057. твин-20 (ТТБР) и разрезают на полоски. Полоски, соответствующие

ДСН-ПААГЭ РИЛ-2 в редуцирующих и не- . редуцирующих условиях и лизаты Е.coli помещают в стеклянные пробирки емкостью 15 мл и добавляют 10 мл супернатанта МКА 1ЗБ1,2. Инкубацию с МКА продолжают 2 ч при 20 С на аппарате с горизонтальным перемешива-, нием. После этого НЦ отмывают 3 раза по 5 мин ТТБР, добавляют козьи антимышиные антитела, разведенные 1/2000 в ТТБР, 1Х БСА и инкубируют 1 ч при

20 С с перемешиванием. После двух о отмывок ТТБР и одной отмывки ТБР реакцию проявляют в растворе субстрата, содержащем 4-хлор-1-нафтол и 0,005

Н О, в течение 20 мин. Для хранения и фотографирования НЦ промывают в дистиллированной воде и высушивают на воздухе.

Результаты исследований свидетельствуют о взаимодействии МКА 1ЗБ1.2 как с мономером РИЛ-2, так и с его мультимерами. Возможность образования многомерных форм РИЛ-2 определяется присутствием 3 свободных сульфгидрильных групп в молекуле ИЛ-2, образующих межмолекулярные дисульфидные связи в процессе очистки РИЛ-2. Димер РИЛ-2 достаточно устойчив и сохраняется даже в редуцирующих условиях. Таким образом, МКА, продуцируемые клетками штамма 13Б1.2, могут быть, использованы для определения РИЛ-2 после ДСН-ПААГЭ и электропереноса на нитроцеллюлозу.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Nus. musculus ВСКК (II) Р 108D, используемый для получения моноклональных антител к рекомбинантному интерлейкину-2 человека. !