Способ определения аденозинтрифосфата

 

Изобретение относится к иммуноанализу биологически активных вешеств и может найти применение в биохимии , молекулярной биологии и производстве меченых фосфором-32(33) аденозинтрифосфатов. Цель изобретения - повьпяение точности способа за счет повышения его чувствительности. Иммунизируют животных конъюгатом производного 5,5-диаденозинтетрафосфатп с бычьим сывороточным альбумином . Получаемую антисыворотку инкубируют с анализируемой пробой в присутствии -у-- р АТФ, разделяют связанный и свободный АТФ адсорбцией на активированном угле, покрытом декстраном. Определяют количество АТФ в пробе с использованием калибровочного графика, построенного по эталонным ,9 пробам с известным содержанием АТФ. Чувствительность способа 5-1 О моль/мл АТФ. (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (51) 4 6 01 N 33/534

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

АТФ .

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (2l) 4099170/28-14 (22) )1.05.86 (46) 23.11 ° 88. Бюл. Ф 43 (7!) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии и Хозрасчетное опытное предприятие

"Радиопрепарат" Института ядерной физики АН УЗССР (72) М.Ю.Рукавишников, Ю,В. Туманов, M.Ï. Гришаев, Е.И. Кубатина, А.Д. Аммосов и М. Абдукаюмов (53) 615.373(088.8) (56) R.Bredehorst et а1. Biochim, Biophys Acta (1981), ч. 652, р.16-28. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДЕНОЗИНТРИФОСФАТА (57) Изобретение относится к иммуно; анализу биологически активных вешеств и может найти применение в био„„,SU„„1439508 А 1 химии, молекулярной биологии и производстве меченых фосфором-32(33) аденоэинтрифосфатов. Цель изобретения - повышение точности способа за счет повышения его чувствительности.

Иммуниэируют животных конъюгатом производного 5,5-диаденозинтетрафосфата с бычьим сывороточным альбумином. Получаемую антисыворотку инкубируют с анализируемой пробой в присутствии -или у †- 1P АТФ, разделяют связанный и свободный АТФ адсорбцией на активированном угле, покрытом декстраном. Определяют количество АТФ в пробе с использованием калибровочного графика, построенного по эталонным пробам с известным содержанием АТФ.

-/

Чувствительность слосолв т.10 моль/мл U) 1439508

Изобретение относится к области иммуноанализа биологически активных веществ и может найти применение в биохимии, молекулярной биологии и в производстве меченых фосфором-32(33)

5 аденозинтрифосфатов.

Целью изобретения является повышение точности способа за счет повышения чувствительности способа. 1Î

Пример l. Получение коньюгата антигена с бычьим сывороточным ал ьбумином.

8-Br АДФ и гексаметилендиамин АДФ получают следующим образом, 15

500 мг динатриевой соли АДФ в

10 мл !M Na-ацетатного буфера (рН

4,3) обрабатывают избытком Br< в течение 40 мин. Избыток Brg экстраги" руют хлороформом, а для удаления ос- 20 татков Br водный раствор обрабатывают 2 мг метабисульфита натрия. Продукт осаждают добавлением 3-4 объ-. емов этилового спирта при -20 С. Оса1 до к О тфиль тровыв ают и промывают Охл аж-25 ! денным спиртом, растворяют в 10 мл воды и добавляют 2 r гексаметилен-диамина. Смесь нагревают при 60-70 о в течение 2,5-3 ч. Для освождения от избытка гексаметилендиамина продукт осаждают спиртом. Осадок промывают центрифугированием, растворяют в воде и хроматографируют на

ДЭАЭ-сефадексе А-25 в аммонийбикарбонатном буферном растворе, рН 7,5.

Для получения модифицированного

5, 5 -диаденозинтетрафосфата (РАр А) гексаметилендиаминовое производное АДФ вводят в реакцию коя" денсации с активированным АДФ.

49

0,06 моль триэтиламмонийяой соли

5 -АДФ сушат упариванием 3 мл безводного ацетонитрила, растворяют в

1,2 мл смеси диметилсульфоксид— этиловый спирт (1:1 по объему) и добавляют 0,3 ммоль 4-диметиламинопиридина, 0,24 ммоль трифенилфосфина, 0,24 ммоль дипиридилдисульфида

{PyS) Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 20 мин (смесь I) Выход 4-диметиламинопиридиниевого производного определяют

ТСХ íà Kieselgel GO, Fz<< предварительно разбавляя аликвоту реакционной смеси 107-ным раствором пиперидина в этиловом спирте и анализируя получающийся устойчивый пиперидяд

АДФ, Rf АДФ-0,05, Rf пиперидида

АДФ-0,3.

Отдельно высушивают 0,077 ммоль триэтиламмонийной соли 8-(6-аминогексаметилен)-аминоаденозин-5 -дифосфата добавлением и упариванием

Зх1 мл ацетонитрила, растворяют в

800 мкл безводного диметилсульфоксида, переносят в смесь I, упаривают этиловый спирт и проводят реакцию при 40 С в течение 2 ч. К смеси доо бавляют 10 мл смеси вода-диметилсульфоксид (1:1) и наносят на колонку с

ПЗИ-целлюлозой НСО -форма,{30020мм)<

Колонку промывают 50 мл смеси водадиметилсульфоксяд (1:1), 50 мл воды, и вьделение продукта проводят в градиенте концентрации ТЭАБ от С до

0,5 И (объем раствора 800 мл, скорость элюции 40 мл/ч, объем фракций

1 5 мл). Выход продукта составляет

657 относительно исходного АДФ. Полученный продукт по времени элюции ионообменной смолы, устойчивости к щелочной фосфатазе, соотношению основание:фосфат (1:2) и спектральным характеристикам в УФ-свете (aцс=

"ìèí

Е 290

= 0,58) соответствует гексаметилеядиамияовому производному Ар>А.

Конъюгирование полученного соединения с БСА проводят по известной методике {10). К 2 мл 0,2 М Na-фосфатного буфера рН 7,5, содержащащего 20 мг БСА и 20 мг производного

Ар+А, по каплям добавляют I мл 0,27.— ного раствора глутарового альдегида

s воде. Добавление диальдегида проводят в ледяной бане, а затем реакционную смесь ннкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч. Непрореагировавший глутаровый альдегид связывают добавлением избытка лизина. Конъюгат очищают от нязкомолекулярных примесей диализом. Содержание

БАр„А в составе конъюгата определяют спектрофотометрическя. Эпитопное число конъюгата равняется 25-27 молекулам диаденозинтетрафосфата на молекулу БСА.

Пример 2. Получение антисывороткн н ее характеристика.

Для иммунизации используют кроликов весом 1,5-2,0 кг. Антиген — коньюгат БСА с 5, 5 -диаденозинтетрафосфатом (БСА-Н-Ар А) в количестве 1 мг растворяют в 0,5 мл физиологического раствора и перед; иммунизацией смешивают с 0,5 мл адъюванта Фрейнда до

3 14395 образования однородной эмульсии. Полученный препарат вводят подкожно в несколько точек спины кролика. Первую инъекцию проводят с применением

5 полного адъюванта Фрейнда. Спустя 2,4 и 8 нед. повторные инъекции проводят с использованием неполного адъюванта

Фрейнда. Иммунизация животными переносится хорошо. Через 9-10 дн. после четвертой инъекции забирают кровь тотально и получают антисыворотку известным путем.

Титр антисыворотки, выраженный в виде концентрации центров связывания 15 антигена Q, и,аффинитет антител к антигену в вице константы ассоциации К определяют в эксперименте по связыванию (— Р ) АТФ антителами

3 из разбавленной антисыворотки путем 2р представления полученных данных в координатах Скэтчарда.Реакцию проводят в буферном растворе, содержащем 50 мИ трис-НС1, 4 мМ ЗДТА (рН 8,2).

К одному и тому же количеству анти- 25 сыворотки (конечное разбавление 1:120) добавляют различные количества (у- P ) АТФ известной молярной радиоактивности и доводят с помощью буферного раствора объем во всех пробах до 30 о„

100 мкл. Смесь инкубируют при 4 C в течение часа. Разделение связавшегося в комплекс с антителами и свободного (у- P t АТФ осуществляют с помощью суспензии активированного угля, покрытого декстраном. После центрифуги рования (2 мин, 6000 g) определяют, радиоактивность супернатанта и рас. считывают количество АТФ,включившегося в комплекс антиген-антитело. 40

Пример 3. Определение количества АТФ.

Все реагенты готовят на буферном растворе, содержащем 50 мМ трис-НС1 и 4 мИ ЭДТА (рН 8,2)(у — Р) АТФ высокой молярной радиоактивности (6000 Ки/ммоль) добавляют в пробы, содержащие известные возрастающие количества нерадиоактивного АТФ (5, 10, 15, 20 и 25 <10 ь моль) . В парал- Б0 лелькой серии пробы содержат неизвестные количества АТФ. Одна из проб не содержит намеченный АТФ (проба сравнения), Объем всех проб доводят буферным раствором до 150 мкл с учетом анти- 6Б сыворотки (разбавление 1:120), которую добавляют во все пробы в последнюю очередь. Пробы перемешивают встряо хиванием и инкубируют при 40 С в те08

4 чение 2 ч. Далее во все пробы, кроме пробы сравнения, добавляют по 50 мкл суспензии активкрованного угля, покрытого декстраном, перемешивают и центрифугируют при 6000 g в течение

10 мин. По 75 мкл супернатанта из каждой пробирки растворяют в 1 мл воды и считаю- на жидкостно-сцинтилляционном счетчике Мага-111.

Предлагаемый способ определения

АТФ прост в исполнении. Для выполнения серии анализов требуется всего несколько мкКи фосфора-32(33), Поэтому способ может быть осуществлен в любой биохимической лаборатории.

Благодаря высокой чувствительности способа чеобходимое для анализа количество фосфора-32 настолько мало, что в совокупности с коротким периодом полураспада делает работу безопасной для здоровья персонала и исключает радиоактивное загрязнение лаборатории. В настоящее время налажен $2 регулярный промышленный вьптуск i Р)

АТФ высокой молярной активности, и, следовательно, эта метка широко дос

s óïíà.

Способ найдет применение прежде всего для техкологического контроля качества продукции — для определения молярной радпо3 <тнвности нуклеозидтрифосфатов высокой удельной активкости. Ранее для определения этой характеристики продукции изотопного синтеза требовалось не менее нескольких мКи (Р ) НТФ. Регулярное проведение таких анализов дорого и требует принятия специальных мер для защиты персонала от облучения.

В области биохимического анализа предлагаемый способ делает возможным измерение содержания этого биологически важного нуклеотида в масштабе отдельной клетки и его вкутриклеточного распределения.

По предлагаемому способу чувствительность анализа определяется как 10 - — 10 " моль/пробу, а

-1

/ по известкому 3 10 моль|пробу.

Специфичност=, определяемая ло величине 50 ингибирования антител с

-АТФ, по предлагаемому способу определяется 1,6, а по известному — 0,37.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ определения аденозинтрифосфата, включавший иммунизацию жиСоставитель В. Литовченко

Техред А.Кравчук

Корректор М. Демчик

Редактор В. Данко

Заказ 6071/44

Тираж 847

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035,.Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 вотного гаптеном, ковалентно связанным с бычьим сывороточным албумином, забор крови, выделение антисыворотки, инкубирование ее с анализируемой пробой в присутствии меченого аналога аденозинтрифосфата, разделение связанного и свободного аденозинтрифосфата и определение количества аденозинтрифосфата по радиоактивной метке, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа эа счет повышения

1439508 6 чувствительности и специфичности радиоиммунного анализа, в качестве гаптена для иммунизации используют

8-(6-аминогексил)-5 5 -диаденоэин

У тетрафосфата, в качестве меченого аналога аденозинтрифосфата используют lo((y) — 32(33) Р)аденозиитрифосфата и разделение связанного и свободного аденозинтрифосфата осуществляют путем адсорбции на активированном угле, покрытом декстраном.