Способ получения ингибитора трипсина

 

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение при выделении ингибитора трипсина с высокой степенью чистоты в биохимической промышленности. Цель изобретения - повышение выхода и степени очистки ингибитора трипсина, а также ускорение процесса. Способ заключается в адсорбции ингибитора трипсина из коричневого сока люцерны на аффинном сорбенте, представляющем собой поливиниловый спирт волокнистой структуры, предварительно активированный п-толуолсульфохлоридом, содержащий 47-60 мг трипсина на 1 г сухого сорбента-, и в последуюп;ей десорбции целевого продукта. Применение данного способа позволяет увеличить выход от 28 до 31-38% и степень очистки ингибитора от 105 до 150 - 159 раз, а также ускорить процесс. Способ быть использован для выделения ингибитор а из многотонажного сырья по зффективной технологической схеме благодаря деЩевизне и хороп1им фильтрующим характеристикам волокнистого поливинилового спирта. 1 табл. (Л 4. 4 О СО ю 4

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (51) 4 С 1- N 11/08

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО.ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21 ) 4224&5 0/ 31-1 3 (22) 27,02.87 (46) 30. 11.88. Бюл. № 44 (7 1) Ленинградский институт текстильной и легкой промышленности им. С.M.Êèðîâà (72) И.И.Свердлова, Г.П.Байкова, В.А.Хохлова, Л.A.Âîëüô, Н.В.Платонова и В.Н.Сухинин (53) 577.15(088.8) (56) Хорунжина С.И. и др. Исследования процесса сорбции трипсина карбоксилсодержащими полив инилспиртовыми волокнами, ЖПХ, т. I, вып. I, 1977, с. 195-196.

Nilsson К., Mosbach K. p-Toluenesulfonylc1ride as an actyvation agent

of agarose for the preparation .of

immobilized affinity ligands and

proteins. — Europ. J. Biochem., 1980, v. 112, № 2, э. 397-402. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА

ТРИПСИНА (57) Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение при. SU„„1440924 А1 выделении ингибитора трипсина с высокой степенью чистоты в биохимической промышленности ° Цель изобретения — повышение выхода и степени очистки ингибитора трипсина, а.также ускорение процесса. Способ заключается в адсорбции ингибитора трипсина из коричневого сока люцерны на аффинном сорбенте, представляющем собой поливиниловый спирт волокнистой структуры, предварительно активированный п-толуолсульфохлоридом, содержащий 47-60 мг трипсина на 1 r сухого сорбента., и в последующей десорбции целевого продукта. Применение данного способа позволяет увели- Я вить выход от 28 до 31-38у и степень очистки ингибитора от 105 до 150 "

159 рав, а также ускорить процесс.

Способ може г быть использован для выделения ингибитора из многотонажного сырья по эффективной технологической схеме благодаря дешевизне и хорошим фильтрующим характеристикам волокнис- age того поливинилового спирта. I табл. вфла

1440924

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение нри выделении ингибитора трипсина с высокой степенью чистоты в биохимической промышленности.

Цель изобретения — повышение выхода и степени очистки ингибитора, а также ускорение процесса.

Способ заключается в ",ом, что для .10 получения ингибитора из субпродукта производства протеинового зеленого концентрата люцерны — коричневого сока путем адсорбции на аффинном сорбенте, в качестве такого сорбента используют поливиниловый спирт (ПВС) волокнистой структуры, а содержание трипсина устанавлтюают равным 47-60 мг трипсина на 1 r сухого сорбента, причем иммобилизацию трип- 20 сина проводят с помощью ковалентного связывания с активированным и-толуолсульфохлоридом поливиниловым спиртом.

При одинаковом содержании трипсина (60 мг/г сухого полимера) известный 25 сорбент, полученный на основе полисахарида (сефарозы CL-6Â) позволяет повысить чистоту ингибитора трипсина в 105 раз, в то время как ПВС обеспечивает очистку его более чем; 30 в 150 раз. При этом выход ингибитора трипсина по активности составляет от 28 и до 31-38% соответственно.

Волокнистая структура ПВС позволяет регулировать скорость прохождения препарата, содержащего ингибитор трипсина (коричневый сок, полученный из вегетативной массы люцерны), через слой сорбента, сократить длительность отмывки его от неспецифи- 10 чески сорбированных белков, а также значительно сократить время десорбции ингибитора трипсина с 240 мин при применении трипсинсодержащей сефарозы CL — 6В до 90 мин при использовании трипсинсодержащего ПВС в виде волокна.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 1 г свежесформованного ПВС волокна отмывают ацетоном от замасливателя и подвергают набуханию в пиридине при 40 С в те чение 30 мин, после чего обрабатывают 10%.-ным раствором и-толуалсульфохлорида в пиридине при 4 С в течение 20 мин. Полученное ПВС волокно, содержащее 0,015 ммоль/групп толуолсульфата, обрабатывают при рН 8,5 раствором трипсина с концентрацией о

1 мг/мл при 40 С в течение 60 мин.

Получают трипсинсодержащее ПВС волокно, в котором фермент в количестве

10 мг (0„4х10 вдоль) занимает место толуолсульфата. Количество прореагировавших гидроксильных групп

ПВС при степени полимеризации СП-1200 в среднем составляет п = 2 1 Продукт промывают дистиллированной водой и обрабатывают 100 мл коричневого сока люцерны, содержащего ингибитор трипсина, который с иммобилизованным трипсином образует комплекс. Разрушение этого комплекса (десорбцию) осуществляют 50 мл О, 1 НС1, активность ингибитора трипсина в растворе составляет ?,3% от исходной, а удельная активность повышается в 173 раза. Остальные примеры исполнены аналогично.

Результаты исследований сведены в таблицу.

Анализ данных таблы ы показывает, что увеличение времени обработки отмытого от замасливателя и обезвоженного ацетоном ПВС-волокна после нао бухания в пиридине при 40 С, 10%-ным раствором п-толуолсульфохлорида в пиридине приводит к возрастанию содержания групп толуолсульфата от

0,015 ммоль/г до 0,07 ммоль/г. При взаимодействии.с трипсином происходит замена активированных групп толуолсульфата на белок, в связи с чем содержание трипсина в ПВС увели чивается с 10 до 75 мг/г. Использование трипсинсодержащего волокна для выделения ингибитора трипсина из коричневого сока показывает, что увеличение содержания трипсина в ПВС влечет за собой увеличение выхода ингибитора трипсина с 7,8 до 39% от начального содержания в коричневом соке. Степень очистки выделенного ингибитора трипсина уменьшается. Учи тывая это, оптимальное количество трипсина в ПВС составляет от 47 до

60 мг/г сухого сорбента.

Таким образом, использование предлагаемого изобретения позволяет получать ингибитор торипсина из коричневого сока люцерны с большим выходом (31-38% вместо 28%) и с повышенной степенью очистки (150-159 вместо 105), а также значительно уско0924

Характеристика процесса очистки ннгибитора трипсина селективными сорбентами с различным содержанием

Р и/и

Н аиме нов ание образца трипсина пень стки

1 Коричневый сок

100 100

00!5 10 04 10

21 7,3 0,04

173

tt

27 1,03 10

23 0,13

31 0,14

167

50

0,027

0,041

47 1, 88 ° 10

159

j00

60 - 0054 60 240 10

150

120 i38 0 15

142 39 0 17

72 2,88 10

75 3,10 1О

75 3,10 10

139 .

О, 063

120 0,080

139

39 0,17

39 0,17

166

166

180

139

О, 070

9 Сефарова

CL-6 В

1э15 60 15э0 10

105

28 0,16

ВНУШИ Заказ 6143/29 Тираж 520 Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 144 рить процесс (на стадии десорбции с

240 мин до 90 мин). ,Одновременно волокнистая структура данного пол1-.мера обеспечивает осуществление технологического процесса выделения биологически активного препарата из многотоннажного растительного сырья по непрерывной схеме с использованием простых технических решений (фильтры из нетканого материала) с сокращением времени проведения процесса.

Формула изобретения

Способ получения ингибитора трипсина, включающий адсорбцию ингибитора трипсина из субпродукта производства протеинового зеленогО концентрата люцерны — коричневого сока на аффинном сор бенте, содержащем трипсин, ковалентно связанный с нерастворимым органическим носителем, активированным п"толуолсульфохлоридом, и десорбцию целевого продукта, о т—

10 л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода и степени очистки ингибитора трипсина, а также ускорения процесса, в качестве аффинного сорбента используют поли15 виниловый спирт волокнистой структуры, а содержание трипсина устанавливают равным 47-60 мг трипсина на 1.r сухого сорбента.