Способ хранения коллекционных культур микроорганизмов

 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам хранения коллекционных культур микроорганизмон. С целью увеличения срока 1 .Изобретение относится к микробиологии , а именно к способам хранения коллекционных культур микроорганизмов . Целью изобретения является увеличение срока хранения культур. Способ осуществляют следующим образом . Суспензию клеток культуры, находящейся в стационарной фазе роста,хранения культур под вазелиновым маслом суспензию клеток культуры, выросшей на благоприятной питательной среде и находящейся в стационарной фазе роста, смешивают с расплавленной желатиновой средой, содержащей глицерин и 1%-ную пептонную воду,при следующем соотношении компонентов, мас.%: желатин 10-20, глицерин 20- 40, 1%-ная пептонная вода - остальное . Полученную смесь закапывают в охлалзденное вазелиновое масло для получения шариков и хранят их при температуре от -5 до -15 С. Суспензию клеток смешивают с расплавленной желатиновой средой, преимущественно в соотношении 1:3, что позволяет формировать желатиновые шарики с достаточным количеством клеток. Предложенный способ позволяет удлинить срок хранения неспороносных бактерий .и дрожжей с 1-2 до 4-5 лет и обеспечивает количественный учет жизнеспособных клеток культур, хранящихся в желатиновых шариках.4 табл. смешивают с расплавленной желатиновой средой (в соотношении 1:3),состоящей из желатина 10-20 мас.%, глицерина 20-40 и 1%-ной пептонной воды, полученную смесь по каплям

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК ©1> 4 С 12 Х 1/04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И A ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬПИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4280887/28-13 (22) 08. 07. 87 (46) 15.03.89. Бюп. У 10 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ (72) Г.Д. Серов, И.С. Андреева и Т.А. Терещенко (53) 557. 15 (088.8) (56) Идельчик М.С., Черняева Л.И., Прокопенко Н.Л. Длительное хранение музейных культур микроорганизмов в виде желатиновых дисков.

Биологические науки, 1983, У 2, с. 97-100.

Методы хранения коллекционных культур микроорганизмов./Под ред.

Н.A. Красильникова, М.: Наука, 1967, с. 91-118. (54) СПОСОБ ХРАНЕНИЯ КОЛЛЕКЦИОННЫХ

КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ (57) Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам хранения коллекционных культур микроорганизмов. С целью увеличения срока

1 ,Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам хранения коллекционных культур микроорганизмов.

Целью изобретения является увеличение срока хранения культур.

Способ осуществляют следующим образом.

Суспензию клеток культуры, находящейся в стационарной фазе роста;

„„SU„„1465454 А I хранения культур под вазелиновым маслом суспенэию клеток культуры выросшей на благоприятной питательной среде и находящейся в стационарной фазе роста, смешивают с расплавленной желатиновой средой, содержащей глицерин и 1Х-ную пептонную воду,при следующем соотношении компонентов, мас.Х: желатин. 10-20, глицерин 2040, 17.-ная пептонная вода — остальное. Полученную смесь закапывают в охлажденное вазелиновое масло для получения шариков и хранят их при о температуре от -5 до -15 С. Суспензию клеток смешивают с расплавленной желатиновой средой, преимущественно в соотношении 1:3, что позволяет формировать желатиновые шарики с достаточным количеством клеток. Предложенный способ позволяет удлинить срок хранения неспороносных бактерий и дрожжей с 1-2 до 4-5 лет и обеспечивает количественный учет жизне» способных кпеток культур, хранящихся в жслатиновых шариках.4 табл.

2 смешивают с расплавленной желатиновой средой (в соотношении 1:3),состоящей из желатина 10-20 мас.Ж, глицерина 20-40 и 1Х-ной пептонной воды, полученную смесь по каплям (0,05 мп) закапывают в пробирки с охлажденным во льду минеральным маслом для получения шариков и хранят их в вертикальном положении при о

-5-(-15) С. Соотношение суспензии и желатиновой среды 1:3 позволяет

14654 54 формировать желатиновые шарики с достаточным количеством клеток.

Для восстановления культуры из хранения петлей шарик вынимают из масла, помещают в пробирку с жидкой питательной средой (1 мл) в термостат при температуре +37 С до полного растворения желатина. Полученную таким образом суспензию клеток рассеивают по 0 1 мл на чашки с оптиФ мальной для данного микроорганизма ! средой. После инкубирования в термостате при соответствующем режиме

1 подсчитывают выросшие колонии, на, ходят среднее число и делают пере счет на 1 мп желатиновой среды, где хранились шарики, сравнивают полученное число с исходным количеством клеток в этой среде перец закладкой культуры на хранение и оценивают эффективность хранения.

Хранению подвергают коллекционные штаммы НИКТИ БАВ: штаммы грамотрицательных неспорообразующих бактерий Escherichia coli, Xanthomonas

malvacearum, штаммы дрожжей Saccharo-. myces cerevisiae, штаммы спорообразующих грамположительных бактерий

Bacillus globigii, Bacillus зиЬ х11з

Bacillus amilo1iquefaciens, Bacillus

sphaericus, грамположительный неспорообраэующий штамм Staphylococcus

aureus, грамвариабельные штаммы неспорообразующнх бактерий Arthrobacter luteus.

После восстановления из хранения штаммы проверяют на соответствие основным признакам (морфология клеток и колоний, чувствительность к антибиотикам, рост на средах с углеводами, образование сероводорода и индола, наличие амилазы, цистиназы,уреазы, желатиназы) на способность к специфической продукции.

Пример 1. Готовят густую суспензию клеток штамма Е.coli В.

Для этого пятью мп 1%-ной пептонной воды делают смыв с 2-3 косяков суточной культуры Е.coli В. 1 мп смыва смешивают с 3 мп растопленной и остуженной до 45 С желатиновой среды (состав приведен ниже), из части полученной суспензии готовят разведения и высеивают по 0,1 мл на 2-3 чаш ки питательного агара, для подсчета

1 / количества жизнеспособных клеток в 1 мл смеси перед закладкой культуры на хранение. 2 мл смеси по каплям (0,05 мп) закапывают в про бирки с охлажденным по льду вазелиновым маслом (20 капель в 1 пробир" ку с 5 мл масла), где капли желатиновой суспензии застывают в виде шариков, пробирку закрывают пробкой и хранят в морозильнике при -5 С.

Для Е.coli В. при исходном титре

1р клеток в желатиновых шариках 3,9

«10 кл/мл титр через 3 года — 1,4 10, через 4 года — 1 10, культура была жизнеспособна и через пять лет,что заметно превышает срок хранения

15 культуры по прототипу.

Основные морфологические, культурально-биохимические свойства культуры Е.cali В, восстановленной из хранения в желатиновых шариках, 2р соответствовали основным исходным свойствам.

Состав желатиновой среды,мас.%:

Желатин 15

Глицерин 20

25 1 -ная пептонная вода Остальное

Приготовление желатиновой среды.

15 г желатина заливают 20 мп

1 .-ной пептонной воды, ставят набу30 хать на 15 мин, затем желатин расплавляют при подогревании на водяной бане, добавляют 20 мп глицерина и доводят объем геля до 100 мл

1 -ной пептонной водой, РН 7,2-7,4 °

Разливают желатиновую среду по 3 мл в пробирки, трижды автоклавируют текучим паром и хранят в холодильнике.

Пример 2. Подготовку споро,1б носной бактерии Bacillus globigii продуцента рестриктазы Bgl I, IIдля хранения в желатиновых шариках проводят, аналогично примеру 1, за исключением того, что концентрации

45 желатина и глицерина в среде составляют 10 и 20 мас. соответствено но и температура хранения -10 С. Ис9 ходный титр культуры 5 t0 кл./мл, 7 через 3 года хранения — 5,6 ° 10

5О через 4 года хранения — .2,5 ° 10, че4 рез 5 лет хранения — 2,8 ° 10

Основные культурально-биохимич еские, морфологические свойства и способность к специфической продукции культуры (рестриктаза Bgl I, II)

55 восстановленной после хранения в желатиновых шариках, соответствовали исходным свойствам, эффективность сохранения жизнеспособности клеток сравнима с результатами хранения по пр от отипу.

Пример 3. Подготовку киллерного штамма дрожжей S ° cerevisiae для хранения в желатиновых шариках проводят аналогично примеру 1 за исключением того, что концентрации желатина и глицерина составляют

20 и 40 мас.Е соответственно и темо пература хранения -15 С. Для выращивания штамма используют плотную и жидкую среду Сабуро. Исходный титр живых клеток дрожжей S ° cerevisiae

6 составлял 1,4 10 кл./мн после 2 лет хранения — 3,3 10, после 4-1 2 ° 10

5 5 после 5 лет — 7, 7 10 . Срок жизнеспособности клеток, хранящихся в желатиновых шариках, превьппает по результатам хранения прототип.

Культурально-биохимические, морфологические свойства и признак киллерности типичны у всех проведенных клонов культуры, восстановленной после хранения в желатиновых шариках

Пример 4. Подготовку культуры S.aureus Cowan I продуцента белка А для хранения в желатиновых шариках проводят аналогично примеру

1 за исключением того, что концентрации желатина и глицерина составляют 15 и 40 мас.7 соответственно и температура хранения -15 С. Исходный титр культуры 2,2 10 кл./мл, через г

3 года хранения 1,1 ° 10, культура жизнеспособна и через 4 года хранения, что превышает сроки хранения

S.aureus под слоем минерального масла в столбиках полужидкого агара.

Культурально-.биохимические, морфологические свойства культуры S.aureus

Cowan I, восстановленной после хранения в желатиновых шариках, соответствовали основным исходным свойствам, способность к продукции белка А сохранялась.

Пример 5. Подготовку культуры Arthrobacter luteus продуцента рестриктазы А lu I для хранения в желатиновых шариках проводят аналогично примеру 1 за исключением того, что концентрации желатина и глицерина составляют (10 и 40 мас.7 соответственно и температура хранения о

-10 С. Исходный титр культуры 4,5»

<10 кл./мп, через 1 год хранения—

7,8-10, через 3 года - 1 10, чев 6 рез 4 года — 4,8 10, через 5 лет—

1,3 10, через 6 лет — 5 10 . Морфо4654 54 6 логия и основные биохимические свойства культуры, восстановленной после хранения в желатиновых шариках, без изменений, способность к .специфической продукции (рестриктаза А lu

I) сохраняется. Сохранность жизне" способных клеток А. luteus в желатиновых шариках сравнима с результатами хранения по прототипу.

Результаты, представленные в примерах 1-5, сведеньг в табл. 1-4.

Из табл.1 видно, что при использовании желатина в среде в концен15 трации менее 107 шарики сливаются, а при концентрации желатина в среде более 20Х вязкость смеси слишком большая, среда трудно раэмешивается и раскапывается (для работы непри20 годна).

При использовании глицерина в желатиновой среде менее 20Х возможно промерзание шариков, концентрация глицерина более 40Х экономически

25 невыгодна, так как не приводит к дальнейшему увеличению срока хранения микроорганизмов.

Как видно из табл. 2 и 3, предла. гаемый способ позволяет давать колиЗ0 чественную оценку эффективности хранения клеток при экономном расходе хранящейся культуры.

Предлагаемый способ позволяет сохранить жизнеспособность неспороносных бактерий и дрожжей до 4-5 лет срок хранения спорообразующих бактерий сравним с результатом по прототипу (5 лет, срок наблюдения).

При использовании. запредельных

4п значений температур хранения эффек тивность хранения уменьшается (см. табл.4) .

Преимущество предлагаемого способа заключается в удлинении срока хранения неспороносных бактерий и дрожжей под вазелиновым маслом с

2 до 4-5 лет и возможности количественного учета жизнеспособности клеток до оценки эффективности хране50

Формула иs о бр ет ения

Способ хранения коллекционных культур микроорганизмов путем выращивания культуры на благоприятной для роста питательной среде, последующего ее хранения под минеральным маслом при пониженной температуре, 14654 54

Желатин 10-20

Глицерин 20-40

17-ная пептонная вода Остальное полученную смесь закапывают в охлажденное минеральное масло для формирования шариков и хранят их в масо ле при температуре от -5 до -15 С. отличающийся тем, что, с целью увеличения срока хранения культур, хранению подвергают суспензию клеток, смешанную с расплавленной желатиновой средой, содержащей глицерин и 17-ную пептонную воду при следующем соотношении компонентов, мас.X:

Таблица 1

Формирование шариков в зависимости от концентрации желатина и глицерина в защитной среде

Соотношение желатина и глицерина в защит-! ной среде

Температурный режим хранения

Примечание

I У L

0 С -5 С -10 С -15 С -20.С! 5X

20%

Желатин, Глицерин!

10%

207.

Желатин

Глицерин

При t ниже

-15 С шарики заФ мер зают

Смесь не используется из-за высокой вязкости

40Х

40Х

407

60Х

Желатин

Глицерин

Желатин

Глицерин

П р и м е ч а н и е . + — шарики формируются, не замерзают, условия пригодны для использования при хранении, — — шарики не формируются, при температуре ниже о

-15 С замерзают, смесь для использования непригодна

107.

40%

15Х

60% 20X

20Х

20Х

35Х

20Х

607.

Желатин

Глицерин

Желатин

Глицерин

Желатин

Глицерин

Желатин

Глицерин

Желатин

Глицерин

Концентрация желатина недостаточна, шарики сливаются, смесь непригодна

1465454

Та блица 2

Сроки жизнеспособности культур микроорганизмов при хранении их по прототипу и предлагаемому способу

Сроки хранения культур под маслом в желатиновых шариках - по предлагаемому способу (годы) т 11с1

TTI t Г

1 1,5 2 3 4 5

1 2 3 4 5 6

Ф +

+ + + +

+ + + +

+ +

П р и м е ч а н и е. + — штамм жизнеспособен, з: — слабая выживаемость штамма, — - штамм нежизнеспособен.

2 ° dn ° и ° 3 зраективиоств креавияа кривтрр свюкроортасиев»сов иреилатае»авс сиосооои

-15 5,2 1сГ

4 1 10

1 5.10

-"- 2 lO

° В

-" «4»510

З, l 1Î

4 ° 4. 1О»

2 101

2 ° 10 г. 1 о

5. 10

1 ° 10»

1 10»

2. 10»

З. 1О и

2 ° 10

1Д»

2.lO

В. coli В В. ol i ИВ В-6ОО

В. Coll tt Н 1вг

E. coli K t2

S.aureus Coaao I

В. globigii

t,9 10»

2,2 10 С 4

1 .10»

6 -10Г

Белок А

Рестрикта»а

ВВР I. «

В. subtilis

В. sphaericus

5 101

210 6710 610

ГГ

Рестриктa»a

Sap R I

Рестриктава

A1u I

Рестриктв»а

Ваи В 1

»аллар г-10

5 -lo г10 е

4 10»

A. luteus

В to 3.10

Ь т

ГГ

1 ° 2: 10 4,5 10

З 1О

4,1 10

5 10

1 10

В.1О

5 10

9-104

В. asiloliquefaciens з -1о г 1о

5 ..t0 6- ltP

1 ° 10

З 10с

1 to», 1 ° 6 10

1-10

t 10

О е

S. cereTisiae 55

S. cereeisiae 56

П р и и е ч а а и е: a - итаии »»4»иесиособеа, титр клеток ва иолсчитивался» б соответствие Осиовисас исиоизивс саойстваи» е иичие свеи»иисческой nponpaiss

I Г

Наименование культур Сроки хранения культур под маслом в п/ж столбиках - по прототипу (годы) Е. coli В

Е. coli MR Е-600

Е. coli NM 182

Е. coli НВ 101

Е. coli К 12

S. aureus Cowan I

Bacillus globigii

Bacillus subtilis

В. amiloliquefapiens

В. sphaericus

S. cerevisiae 55

S. cerevisiae 56

А. luteus, Х. malvacearum

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +!

1465454

Т а блица 4 наименование культуры

Количество жизнеспособных клеток через год хранения их в желатиновых шариках при различных температурах (кл. /мп) I

ОС -5C -10С -15C, -20 С

1 10 о

П р и м е ч а н и е. При хранении на -20 С шарики смерзлись, культуры титровались после размораживания

Составитель В. Соина

Техред М. Ходанич Корректор, М. Демчнк

Редактор А. Лежнина и

Заказ 910/28 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðoä, ул. Гагарина,!01

luteus 112

luteus 113 со1 i RI-1 3

col i В . malvacearum

Исходный титр клеток (кл./мл) 5 10

6,8 10

4 ° 10

3 ° 10

5,4 ° 10

1 ° 10

Культура погибла

7,6 10

8,6 10

2,9 10

4,5 10

1 ° 10

7,7 10

6,1.10

2,2 ° 10

4,7 ° 10

3 ° 10

3,4 10

8,5 10

9,4 10

4,8 10

2 10

4 ° 10

3 10

1 ° 103

1 ° 10

Культура погибла