Способ получения 1,4 @ -дисахаридов,состоящих из звеньев структуры @ -глюкозамина и гликуроновой кислоты

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

COLLHAËÈÑÒÈ×ЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51)4 С 07 Н 15 04//А 61 К 31 70

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

Il0 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

/ !

/

--l

g >, >

Цель — создание нового способа получения указанных веществ. Их синтез ведут реакцией двух моносахаридов общей формулы II u III

ОАс COOR1

ОВ ОВ

В О Х О ОВ з "х ио(о),so л

Н0 где Z-МН, МН-С (0) СН з,, NHS (O) g OM;

А - С(0)ОК,; С(0)ОМ; R -С,-С,, -алкил;

К1- ни ий а киэ И вЂ” щелочной металл, позволяющих регулировать неко.торые стадии коагуляции крови, что может быть использовано в медицине.!

Изобретение относится к химии ди- из звеньев структуры D-глюкозамина сахаридов, а именно к способу полу- "и гликуроновой кислоты общей формучения новых дисахаридов, состоящих лы (21) 3528900/23-04 (86) РСТ/FR 82/00076 (28.04.82) (22) 27.12,82 (31) 8108472 (32) ?1.04.81 (33» FR (46) 30.03.89. Г>юл. »« 12 (71) Шоай С.А, (FR) (72) Морис Петиту, Пьер Синан, Жан Шоай и Жан-.Клод Лормо (FR) (53) 547.458,2.07(088,8) (56) Merchant Z.М. and oth. Structure

of heparinderived tetrasaccharides.—

Biochem. ?,, 1985, 229, р. 369-377. (54) СПОСОБ ПОЛУЧГ!!!И 1,4 d-ДИСАХ РИЛОВ, СОСТОЯ!ИХ ИЗ ЗВЕ1!ЬКВ СТРУКТУРЫ .D-Г>ПОКОЗАИ!ПА И ГЛИКУРОНОВОИ КИСЛОТЫ (57) Изобретение касается производных дисахаридон, в частности получения

1,4 - -дисахаридов общей ф-лы („SU „„1470196 А 3 где АС вЂ” ацил;

Вя — бензил; Х - галоген; R и R, Я

8 указаны. В процессе используют катализатор (соль серебра трифторметан- Q) сульфокислоты) и акцептор НС1 (симколлидин) и органический растворитель. Затем полученный продукт после- р довательно обрабатывают сильным основанием, алкилирующим сульфатирующим — (СН з) зИ/Яоз, и гидрирующим аген- « тами с использованием в последнем случае Pd/Ñ. Выделение целевого про- 1 ) дукта ведут либо обработкой уксусным «4 ангидридом в слабоосновной, среде, Я;, » либо гидроокисью щелочного металла ©» с комплексом (СИ.)И/SO . Полученные вещества могут быть использованы в качестве субстракта для изучения ферментной активности. 2 ил.

1470196 ную фазу промывают водой и вйсушенный

10,растворитель выпаривают.

20 где Z-NH,2, ЯНСОСНз ИНБО Иэ

К вЂ” С вЂ” С+ -анкил, A — СООТГ „СООИ1

R — HHSIIIHH алкил; .1

И вЂ” щелочной металл, которые могут быть использованы в качестве активного начала в лекар-! ственных средствах, позволяющих регулировать некоторые стадии коагуля ции крови1

Целью изобретения является раз( работка доступного способа получения

1,4at--дисахаридов, состоящих из звеI ньев структуры Э-глюкозамина и гли1 куроновой кислоты.

Пример 1. Получение метил(метил-2 3-ди-О-бензпл"at-D-гликопиЭ ранозид)уроната.

В 20 мл метиленхлорида вводят, (I при перемешивайии в течение ночи в темноте смесь 0,75 r (2 ммоль) метил2,3-ди-..О-бензил-с(-Э-глюкопиранозида, 20 мг. (0,08 ммоль) диметиламинпиридина, 0,6 мл (4 ммоль) триэтиламина и 0,84 г (3 ммоль) тритилхлорида (трифенилметилхнорид).

Методом тонкослойной хроматографии (метанол/хлороформ 0,2/20, объем/объем) установлено, что реакция полностью завершена.

К этой смеси последовательно добавляют 0,6 мл (4 ммоль) триэтиламина, 0,35 мл (3 ммоль) бензоилхлорида, 50 мг (0,20 ммоль) диметиламинпиридина и прбдолжают перемешивание еще в течение 2 сут.

Для удаления группы тритил к смеси добавляют 0,5 М раствор п толуолсульфокислоты в метаноле (20 мл).

Через час смесь разбавляют метиленхлоридом, затем промывают водой .до нейтральной реакции. Продукт очищают методом колоночной хроматографии (40 r) с применением смеси эфир/ гексан (3/1, объем/объем). Получают чистую белую пену (0,84; 87,7Ж), которую немедленно окисляют.

Растворяют 480 мг (1 ммоль) продукта в 8 мл ацетона и добавляют при О С к охлажденному раствору при перемешивании раствор оксида хрома

55 (UI) в 3,5 М серной кислоте (1, 15 мл раствора хрома содержит 1,17 г в

5 мл).

Смеси дают нагреться до температуры окружающей среды., затем через

2 ч добавляют лед и воду и экстрагируют продукт хлороформом. ХлороформПолученную пену растворяют в метаноле (10 мг/мл) и добавляют едкий натр (5 мл ЗМ раствора).

Через 3 ч водную фазу промывают дважды эфиром, затем подкисляют соляной кислотой. После этого продукт экстрагируют эфиром. Органическую фазу промывают водой, сушат и концентрируют.

Полученный таким образом раствор метилируют диазометаном в эфире и очищают на колонке с силикагелем (15 r) в смеси эфнр/гексан (2,1, объем/объем).

Выход 233 мг; 57,9Ж.

Соединение кристаллизуют из смеси гексан/эфир и получают следующие характеристики: т. пл. 82 С; pat) р +

+ 17,5 (с = 1, хлороФорм); ЯИР-спектр

1Н. (внутренний стандарт NeuSi);

2э9 (dý 1Нэ ОН) Зэ35 ($э ЗНэ ОСН з) °

3,69 (S, ЗН; COOCH Р; 7,27 (12Н1

2Ph).

Найдено, Х: С 65,53; Н 6,29.

С„Н„О,;

Вычислено, Х: С 65,65; Н 6, 51.

Пример 2, Получение дисахарида (3 - см. схемы на фиг. 1 н 2).

Синтез этого дисахарида (3) осуществляют исходя из моносахарндов (1) и (2) по следующей методике..

Реакцию проводят при О С в атмосфере о азота и под защитой от света.

К раствору соединения (2) (40 мг) в безводном днхлорметане (2 мл) постепенно добавляют соединение (1) (98 мг), сим-коллндин (35мкл) и трифлат серебра (серебряная соль трифторметансульфокислоты) (56,5 мг).

Через 1 5 ч реакционную смесь разбавляют дихлорметаном (50 мл). Раствор фильтруют, промывают насыщенным раствором бикарбоната натрия (два раза по 20 мл), затем водой н в за-. ключение высушивают.

ПЬлученный сироп после выпаривания хроматографируют на силикагеле (15 г) в системе этилацетат/гексан (1/3, объем/объем).

70196 6, Продукт (6) (14 мг) растворяют а воде (5 мл) рН доводят до 9,5 путем

Р добавления 0,1 н. раствора едкого натра и поддерживают на этом уровне автоматически. Добавляют комплекс триметиламин/ЯОз (20 мг). По прошествии ночи еще добавляют комплекс (30 мг). Через 24 ч добавляют 1 н. раствор едкого натра (1 мл) и оставляют на 1 ч при температуре окружающей среды. После пропускания через

+ катионообменную смолу (DOWEX 50 WH ) и последующей нейтрализации едким натром соединение (10) очищают, как описано для соединения (8) (обессоливание, ионный обмен, .обессоливание).

5 14

Получают таким образом дисахарид (3) (60,2 мг; 74Х)., ЯИР-спектр подтверждает требуемую структуру: наблюдаемые сигналы (внутренний стандарт

MeuSi); d ; 1 95 (S ЗНэ ОСОСНз)э

3,34 (S, 3H, ОСН.); 3,68 (S, ЗН, СО-О-CH ); 5,53 (d, 1Н, 3,5 Гць

Hi -1); 7,20 - 7,40 (m, 20H, 4Ph).

Пример 3. Получение дисахарида (6).

На первой стадии а) осуществляют омыпение группы — ОАС в положении

6 звена D-глюкозамина, затем выполняют стадию в) сульфатирование группы — ОН в положении 6, и на стадии с) гидрирование — удаляют защитные группы Bz и одновременно переводят группу — Из в группу — МНг.

Получение дисахарида (4) омыпением.

Растворяют соединение (3) в метаноле (10 мл), затем добавляют 1 н. раствор едкого натра (2 мл.). Через

3 ч раствор нейтрализуют пропусканием его через ионообменную смолу

>0 )(50< х 4 Н (5 мл). После концентрирования остаток метилируют диазометаном с целью повторного введения метиловой группы, удаленной одновременно с ацетатом. Таким образом получают соединение (4).

Получение дисахарида (5) сульфа- . тированием.

Соединение (4) растворяют в безводном диметилформамиде (3 мл). Затем добавляют комплекс триметиламина

/S0> (20 мг) и оставляют на ночь при

65 С. Потом смесь выпаривают досуха, растворяют в хлороформе, разбавляют метанолом, затем пропускают через колонку со смолой 0ОИЕХ 50-Na

Органическую фазу промывают водой, сушат, затем выпаривают хлороформ.

Получают соединение (5) (40 мг).

Получение дисахарида (6} гидрированием.

Соединение (5) растворяют в метаноле (10 мл) и воле (1 мл}. Добавляют 40 мг 57.-ного палладия на угле и подвергают действию водорода s те- чение 48 ч, После фильтрования и выпаривания получают соединение (6) (29 мг).

Пример 4. Получение дисахаридов (7) и (8).

Эти производные получают, подвергая дисахарид (Ь) реакции ацетилирования группы — НН,звена глюкозами5

40 новой структуры глюкозамина с последующим омылением группы — COOYe звена структуры уроновой кислоты.

Соединение (6) (14 мг) растворяют в метаноле (3 мл). рН доводят до

8 при помощи 1 н. раствора едкого натра. Затем добавляют уксусный ангидрид (100 мкл}, Через 30 мин выпаривают досуха. Остаток растворяют в воде (1,5 мл) и добавляют 1 н. раствор едкого натра -(0,5 мл), После выдержки в течение ночи при температуре окружающей среды раствор ней" трализуют соляной кислотой. Затем продукт обессоливают пропусканием через колонку Sephadex G — 25 (1,8 х х 20 см). Фракции, содержащие про" дукт, соединяют и хроматографируют на анионообменной смоле (AG 1 х 2

200-40U меш; слой 1 мл). Продукты элюируют с повьш ением концентрации элюента хлорида натрия от О до ЗМ, После соединения фракций, содержащих . соединение (8), последнее обессоливают путем пропускания через колонку

Sephadex G - 25, примененную выше, m = 3,4 мг.

Строение соединения (8) подтверждено определением содержания уроновой кислоты, глюкозамина и сульфатов, а также ЯМР-спектром. Его УФ-спектр показывает максимум абсорбции при

205 нм.

Пример 5. Получение дисахаридов (9) и (10).

Для получения этих производных дисахарид (6) подвергают сначала реакции сульфатирования с целью превращения группы NH< в группу ИНБО. Яа, затем реакции омыления группы СООСН» как указано выше.

1470196

10002000 ед/г

GSQ СОО

g6 0,M

ИИЭ ОН отсутствует

7

Таким образом получают 2,9 мг продук-. та (10).

Строение продукта (10) подтверждено определением содержания уроновой

5 кислоты, глюкозамина и сульфатов, а также ЯМР-спектром.

Биологическая активность. АитиХа-активность обнаружена у дисаха« ридов изобретения, тогда как другой

1 тип дисахаридов, описанный Merchant и др., является негативным.

Дисахариды .Активность па

Yin-Wess Ler

Глюкозамин-глюкуроновая 15 структура по изобретеВ = аце,гил или сульфат

R = алканоил

Глюкоэамин-удуроновая структура по уровню техники:

Использование указанных сахаридов формул 8 и 10 по изобретению в качестве субстрата для сульфамидазы, работая по методу Hopwood и Eliott Н. для детектирования синдрома Sanfilippo, типа А, дает результаты, которые можно сравнить с результатами, полученными с названными сахаридами, содержащими глюкозаминN-сульфат, используемый Hopwood u

Eliott.

Дисахариды могут быть использованы в качестве субстрата для изучения ферментной активности, в частности, для проведения ферментативного расщепления.

Субстрат помещают в ферменты типа af-глюкозаминидазы, гепаритиназы, гепариназы, N-десульфатазы и через определенные интервалы определяют степень разделения путем подачи продукта реакции в жидкостный хроматограф под большим давлением.

Таким образом можно исследовать

1распадение цепей уроновой кислоты1глюкозамина гликозаминогликанов типа гепарина.

Во-вторых, дисахариды можно использовать н качестве эталонных проПреимущества, связанные со структурой. В результате синтеза удалось получить соединение дисахарида, ко.торое встречается в природных цепях гепарина, и это. соединение имеет измеряемую биологическую активность. 40

Этот результат нельзя было получить ввиду деполимеризации гепарина.

Деполимеризация вызывает изменение структурных групп цепей,. В случае, предусмотренном в работе Merchant u др., удуроновая группа сахарида имеет двойную связь.

Получение путем синтеза дисахарида, обладающего биологической активностью и соответствующего соединению, которое встречается в природе в гепарине, представляет значительный прогресс, используемый для получения более длинных цепей гепарина, чего не позволяет осуществлять известный уровень техники.

Субстрат для исследования фермеитативной активности. дуктов.

Благодаря анти-Ха-активности дисахаридов (подавление фактора Ха крови) их можно использовать при исследо1вании соотношения структуры с активНостью путем сравнения с продуктами, полностью лишенными активности, или, наоборот, которые очень активны, типа мукополисахаридов или олигосахаридов, полученных путем экстрагирования или химической или энзиматической деполимеризации гепарина.

Преимущества данных дисахаридов заключаются в следующем.

До изобретения не описан способ гликозилирования по положению 4 гликуронового звена, а также способ синтеза олигосахаридов,, содержащих сахаридное звено, соединенное со звеном глюкуроновой кислоты.

Известны гексасахариды с 6 звеньями сахарозы, обладающие активностью в 2000 единиц Х1п Wessler (такая активность служит указателем антитромбической активности).

Известны также октосахариды (8 звеньев) наряду с другими олигосахаридами, содержащими достаточно большое число звеньев сахарозы.

9 147019

Однако во всех перечисленных случаях речь шла о продуктах, полученных деполимеризацией гепарина или экстрагированием, а не путем синтеза.

Очевидно, что лишь путем синтеза

S можно с уверенностью, воспроизводимостью и более высоким выходом получить продукт заданной структуры с необходимыми замещениями.

Важно отметить, что деполимеризация гепарина сопровождается видоизме» неннем звена в начале или в конце цепи олигосахарида.

При разложении гепарина ферментативным путем в начале цепи образуется ненасыщенное уроновое звено, а при разложении химическим путем конечное глюкозаминовое звено преобразует в звено структуры 2,5-ангидроманно.

Дисахариды, получаемые разложением под действием азотистой кислоты, т.е. указанные гексасахариды, не обладают антитромбической активностью и не могут использоваться в качестве эта 25 лонных продуктов при исследованиях связи между структурой и активностью.

А в силу видоизменения концевого звена они представляют значительно меньший интерес в сравнении с про- З0 дуктами по данному изобретению, обладающими неповрежденной структурой в отношении звеньев, образующих гепарин.

Олигосахариды также получали путем экстрагирования, т.е. не происходило видоизменения их звеньев, как при деполимеризации. Однако такие олигосахариды содержат от 4 до 2б сахаридных звеньев и имеют активность 40

Iin — Messlera выше 100. В силу большой активности такие продукты не .могут быть эталонами, как продукты по данному изобретению, пригодные именно по причине их малой активности.

Формула .из обрет ения

Способ получения 1,4d -дисахаридов, состоящих из звеньев структуры

Ь 10

Э-глюкозамина M гликуроновой кислоты, общей формулы где Z NHq, ИНСОСНз, NHSOsM

А — C00R СООМ;

К вЂ” С,-С,=алкил;

R низший алкил;.

М вЂ” щелочной металл, взаимодействием двух моносахаридов общей формулы

QAc CO0l1

О ов „ ов в о ю ов

>3 где Ae — ацил;

Bi - бенэил, Х - галоген;

Е и R — имеют укаэанные значения, 1 в присутствии в качестве катализатора соли серебра трифторметансупьфокислоты и ацептора кислоты, такого как сим-коллидин, в среде органического растворителя, с последующей обработкой полученного.дисахарида сильным основанием, а затем алкилирующим агентом с последующим сульфатированием полученного дисахарида с помощью комплекса триметиламин/SO>, гидрированием с использованием в качестве катализатора палладия на угле, выделением целевого продукта или обработкой его уксусным ангидридом в слабоосновной среде и вьщелением полученного продукта или обработкой его гидроокисью щелочного металла и комплекснья соединением триметиламин/

/50> .

1470196

G3n

ВдО Вй (2)

СОЛО

О ОИО

0вп

Р) 8оуа Сооме жн он (6) о ма eood ма СООИе но -о оке

:КНАс ОН (И!

osogee соома О но о оие юнас он

Редактор О. Спесивых

Заказ 1369/59 Тираж 339. Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Рауаская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина,101 ()

08Gq_#_a СООМЕ о . о .ВпО О eNe овп (s

ОЗО юп ОООЙ о

БО 0 О3. И вн (о) он.

О

Н0 О щ, ЗОЗ Он (9)

ЗОзма СООКа о о но о оке 80+6 0Н ,.z (Ю) Составитель С. Полякова

Техред М.Моргентал Корректор О. Кравцова