Способ получения модифицированного кремнеземного носителя для иммобилизации биоспецифических лигандов

 

Изобретение относится к способам получения модифицированного кремнеземного носителя для иммобилизации биоспецифических лигандов и позволяет снизить неспецифическую сорбцию белков и упростить способ. Макропористый кремнезем с диаметром пор 50-230 нм смачивают 3-10%-ным раствором сомономеров в органическом растворителе (6-22% от массы кремнезема), при этом сомономеры - N -нитрофенилакрилат и акриламидберут в мольном отношении от 1:3 до 3:1. В смесь добавляют диметакрилат олигоэтиленгликоля (ТГМ-3, ТГМ-13) в количестве 5-10% от массы мономеров и лаурилпероксид в количестве 0,5-2% от массы мономеров. Реакционную смесь перемешивают, вакуумируют, нагревают до 70°с и выдерживают 3 ч. Продукт промывают диметилформамидом, этанолом и высушивают. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1

„„SU„„1477439 (я) 4 H 01 D 15/08

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4220621/23-26 (22) 01.04.87 (46) 07.05.89. Бюл. 11- 17

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (72) В.В. Жильцов, А.F.. Иванов, В.П. Зубов, В.В. Гузеев, С.И. Туркин,.

В.С. Этлис, Е.П. Бешенова, И.П. Васянин, Г.Л. Кустова и В.С. Князев (53) 543.544 (088.8)

1 (56) Модифицированные кремнеземы в сорб ции, катализ е и хр амат о гр афин, /

Под ред. Г.В.Лисичкина. - N. Химия, 1986, 248 с.

Патент США N - 4415631, кл. 428-405, 1983. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОГО КРЕМНЕЗЕМНОГО НОСИТЕЛЯ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ БИОСПЕЦИФИЧЕСКИХ ЛИГАНДОВ

Изобретение относится к способу получения полимеризационно-модифицированных кремнеземов и может быть использовано для иммобилизации биоспецифических лигандов.

Цель изобретения — снижение. неспецифической сорбции белков и упрощение способа.

Пример 1. В 5 r сухого диметилформамида растворяют 7,1 r акриламида (0,1 моль), в 400 мл бензола растворяют 0,318 г лаурилпероксида и 19,3 г (0,1 моль) п-нитрофе-. нилакрилата. Растворы при перемешивании смешивают. Затем к этому раст(57) Изобретение относится к способ ам получения модифициров анного кремнеземного носителя для иммобилизации биоспецифических лигандов и позволяет снизить неслепифическую сорбцию белков и упростить способ. Макропористый кремнезем с диаметром пор

50-230 нм смачивают 3-107-HbIM раствором сомономеров в органическом растворителе (6-227 от массы кремнезема)„ при этом сомономеры — п-нитрофенилакрилат и акриламид — берут в мольном отношении от 1:3 до 3:1. В смесь добавляют диметакрилат олигоэтиленгликоля (ТГМ-З, ТГМ-13) в количестве

5-107. от массы мономеров и лаурилпероксид в количестве 0,5-2Х от массы мономеров. Реакционную смесь перемешивают, вакуумируют, нагревают о до 70 С и выдерживают 3 ч. Продукт промывают диметилформамидом, этанолом и высушивают. 1 табл.

2 вору добавляют 1,3 мл ТГМ-3 (5% от массы мономеров) . Приготовленную смесь помещают в предварительно загруженный 180 ." макропористого стекла с диаметром пор 2300 А и удель1 ной поверхностью 28 м "/г реактор объемом 0,01 м . Реакционную смесь перемешивают в течение 5 мин. Вакуумируют раствор и нагревают реакционную смесь до 70 С. В течение

3 ч проводят модифика1 им кремнезема сополимером. Ла г кончяпии прививки кремнезем праю.в:-.я1т и. рячим диметилформамидом, ф < ь т и-м буфером рН 4,5, этансл, 4 р.r; и сушат! 477439 ня лиофнл иной сушке. Последующая обработка мпли Ьицировянного кремнезе ма 25 -»ым раствором водного аммиака дает содержание 90 мкмоль и-нитрофенилакрилатных групп ня 1 г твердой фазы. Ход реакции контролируют спектрофатаметрически при „„„,=405 нм, фиксируя количество выделЯвщегосЯ EIHTPoAPEIoJIR !

О

Пример 2, Синтез носителя проводят по примеру 1, но на 19,3 r п-нитрофенилакрилата (0,1 моль) берут 21,3 r акрнламидя (0,3 моль), а лаурилпероксид берут в количестве

0,8 г, содержание и-нитрофенилакри латных групп составляет 20 мкмоль на 1 r твердой фазы.

Пример 3. Синтез носителя проводят по примеру 1, но на 19,3 г ,п-нитрофенилакрилата (0,1 моль) берут 2,4 r (0,033 моль) акриламида, а ТГМ-3 добавляют в количестве 2,2 г (10 от массы мономеров). Содержание

t1-HHTPoABHHJIRKPHJIBTHElx гРУпп составляет 60 мкмоль на 1 г твердой фазы.

Пример 4. Син гез носителя проводят по примеру 1, но на 19,3 г и-нитрофенилакрилата (О, 1 моль) берут

35, 5 r акриламица. Содержание и-нит- 30 рофенилакрилатных групп составляет

2 мкмоль на 1 г твердой фазы.

Пример 5. Синтез носителя проводят по примеру 1, но на 19,3 г и-нитрофенилакрилата (0,1 моль) берут 1,4 r акриламида. Содержание и35 нитрофенилакрилатных групп составляет 10 мкмоль на 1 r твердой фазы.

Пример 6. Синтез матрицы проводят по примеру 1 „но берут 3,5 r акриламида и 19,6 г п-нитрофенилакрилата, а вместо 1 мл ТГМ-3 добавляют 1 мл ТГМ-13, Содержание п-нитрофенилакрилатных групп составляет

80 мкмоль на 1 г твердой фазы.

Пример 7, МодиАикация кремнезема сополимером акриламида и инитрофенилакрилата с соотношением сомономеров 3:1.

Синтез проводят по примеру 2, но

ТГМ-3 добавляют в количестве 6 г (15% от массы мономеров). Содержание и-нитрофенилакрилатных групп составляет 30 мкмоль на 1 r твердой фазы.

Пример 8. Для блокирования

55 активированных групп и последующего определения неспецифической сорбции белков 1 r носителя, полученного по предлагаемому способу, прибавляют в О мл 5,-нот о раствора этяноламиня в диметилформямиде и перемешивают при встряхивании 24 ч. Раствор этаноламиня декантнруют, инактивированный носитель промывявт 3 раза по

50 мл 0,05 М натрийфосфатного буфера (рН 7,0), содержащего О,! М ИаС1 и помещают в колонку размером 1а6 см.

Неспецифическую сорбцию (-химотрипсина и альбумича определяют в указанном буАере при нанесении 3 мг белка в 0,3 мл буАера. Злюируют со скоростьв 0,5 мл/мин. Сорбцив хрома-С определяют в условиях известного способа: 0,0? М фосфатный буфер, рН 9,0. Колонка 1<34 см, проба белка

1 мг в О,i мл буфера. Содержание белка в элюате определяют по Кумасси. В таблице представлены сравнительные резу льтаты.

Пример 9. Определение емкости активированного носителя по иммуноглобулину G. К 1 мл 10%-ного раствора иммуноглобулина G человека прибавляют 4 мл бикарбонатного буфера (0,3 М раствора ИаНСО!, содержащего 0,1 М NaC1), К полученному раствору прибавляют 1 r активированного носителя, встряхивают и инкубируют

24 ч нри 4 С. Затем носитель промывают на пористом фильтре 50 мп бикарбонатного буАера, фильтрат диализуют против того же буфера, после чего измеряют его объем и оптическую плотность при Я = 280 нм (П, ), 1 мл 10 ного раствора иммуноглобулина разбавляют бикарбонатным буфером до объема фильтрата и измеряют оптическую плотность при Ъ = 280 нм (Л ).

Емкость активированного носителя рассчитывают по формуле

1)

С = - - 100 тг !

Величины неспециАической сорбции белков на носителях по примерам 1-7 и емкость носителей по иммуноглобулину С представлены в таблице.

Носитель, полученный по предлагаемому способу, позволяет иммобилизовать значительные количества белка (до 65 мг/г носителя), обладает при этом низкой неспециАической адсорбцией белков (0,2-0,3 мг/г носителя) и может служить исходной основой для получения большого количества афинных сорбентов. Кроме того, носитель обладает всеми преимуществами твер477439 б при их молярном соотноюенни (1-3):

:(3-1) в присутствии снивающего агента — диметакрилата олигоэтиленгли5 коля а в качестве инициатора полиУ мериз ации используют лаурилпероксид, Емкость

Неспецифическая сорбция, мг/г

При10 мер по иммуногло» булину, мг/г

Аль- Хим буьжн от рип; син

Фо р мул а из о б р е т е ни я

Способ получения модифицированного кремнеземного носителя для иммобилизации биоспецифических лигандов, включающий обработку макропористого кремнеземного носителя раствором сомономеров и-нитрофенилакрилата и амида акриловой кислоты с последующей полимеризацией сомономеров в присутствии инициатора, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью снижения неспецифической сорбции белков и упрощения способа, кремнезем 25 обрабатывают раствором сомономеров

Известный носитель—

Составитель Т.Чиликина

Редактор Н.Тупица Техред М.Дидык Корректор .З.Лончакова

Заказ 2188/10 Тираж 600 Под писн о е

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

l 13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

1 докаркясных хроматогрофических материалов — высокой механической прочностью, ненабухаемостью в органических растворителях, устойчивостью к действию микроорганизмов и, следовательно, может быть использован в массивных колонках с высоким давлением и высокой скоростью потока элюента.

2

4

6

0,1

0,1

0,2

0,2

1,0

0,1

1,0

0,2

0,2

0,3

0,3

1,5

0,2

1,2

Ов1 65

0,1 60

0,15 65

0,15 10

0,5 15

0,1 65

05 20