Способ получения простагландинов

 

Изобретение относится к биотехнологии простагландинов (ПГ) и представляет собой новый способ получения ПГ. Цель изобретения - повышение выхода продукта. Способ осуществляют путем инкубирования арахидоновой кислоты с буферным экстрактом актиномицета STREPTOMYCES SPHEROIDES ВКПМ S-573 (фермент липоксигеназа) при 37°С в течение 7 мин при аэрации, осаждения белков, и экстракции и хроматографирования. Степень конверсии арахидоновой кислоты составляет до 50%.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК, (51)4 С 07 С 177/00, С 12 P 1/06// (С 12 Р 1/06, С 12 R 1Ф465) ЬСЕСОЮЗНАЯ

AATEHTHQ Тсй ЧеС

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Б. ; Б и . 3;;

H А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ЯО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4308781/31-I3 (22) 23.09.87 (46) 30.07 ° 89. Бюл. № 28 (71) 1-й Московский медицинский инс-.. титут им.И.M.Ñå÷åíoâà и МГУ им.М.В.Ломоносова (72) JI.Â.Êàsàícêàÿ, Т.В.Максимова, А.Ю.Кривова и, M.À.Аль-Нури (53) 669.15 (088.8) (56) Милман И.А. и Фрейманис Я.Ф.

Микробиологический синтез и превращение простагландинов. Прикл.биохим. и микробиол., 1986, 22, № 5, с,595606.

Брагинцева Л.M. Зеленева P.Н. и,др. Трансформация арахидоновой кис;лоты грибом Trichothecium rozeum

LK ex FK. Прикл.биохим. и микробиол., 1986, 22 № 1, с.22-24 °

Изобретение относится к биотехнологии простагландинов (ПГ) и представляет собой новый способ получения ПГ, которые могут быть использованы как лекарственные средства в медицине и сельском хозяйстве. Цель изобретения — повышение выхода продукта.

Способ осуществляют путем инкубирования арахидоновой кислоты с буферным экстрактом актиномицета Streptomyces sphегоides, штамм ВКПМ S-573 (фермент липоксигеназа) при 37 +0,5 С в течение 7 мин при аэрации, осаждения белков, экстракции и хроматографирования.

Пример 1. Актиномицет Act.

sphегоides M8-2 выращивали на ско. Я0 1497185 А 1

2 (54)СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОСТАГЛАНДИНОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии простагландинов (ПГ) и представляет собой новый способ получения

ПГ. Цель изобретения — повышение выхода продукта. Способ осуществляют путем инкубирования арахидоновой кислоты с буферным экстрактом актиномицета Streptomyces sphегоides BKIIM

S-573 (фермент липоксигеназа) при

37 С в течение 7 мин при аэрации, осаждении белков, экстракции и хроматографирования. Степень конверсии арахидоновой кислоты составляет до

50Х. шенном мясопептонном агаре при 28 С в течение 10 дн. Затем культуру актиномицета с одной пробирки переносят в 200 мл питательной среды содержащей, г/л: соевая мука 20; серно-кислый аммоний 3; хлористый натрий 2,5; однозамещенный фосфат калия 0,75; углекислый кальций 3, для выращивания посевного материала.

Посевной материал выращивают на качалках (180-200 об/мин) в колбах емкостью 750 мл с 200 мл среды в о каждой в течение 72 ч при 28 С. Затем посевной материал в количестве 57. вносят в синтетическую среду извест-. ного состава, г/л: глюкоза 70; цитрат натрия 4, 4 8; серно-кислый магний 5,75; серно-кислый аммоний 1,25;

1497185

ВХ ПГЕ 0,75-0,80

ПГГз 0,6-0,65

Rf ПГРз 0,2-0,25

ПГВ5 0,35-0,40

3 однозамещенный фосфат калия 2,0; сепно-кислый цинк 0,01; серно-кислое железо 0,02, и выращивают тем же способом в течение 3 сут прн 28 С. ь

Выделение мицелия и получение экстракта. ,Культуральную жидкость отделяют от мицелия центрифугированием при

3000 об/мин в течение 5 мин, осадок

3 раза промывают физиологическим растворЬм, отделяя промывные воды.

К 50 r (сырая масса) отмытого мицелия вносят 20 мл 0,01 М трис-НС1 буфера рН 8,0. Полученную суспензию подвергают разрушению посредством УЗ.

Разрушение проводят в условиях постоянного охлаждения (температура не вьппе 10 С) при 22 кГц, 220 В, общее

У время разрушения 3 мин, интервал 2р обработки УЗ составил 3 с с перерывом в 2-3 мин для устранения возможности инактивации ферментов в результате разогрева.

Полученную после разрушения УЗ 25 суспензию центрифугировали при

f8 тыс. об/мии в течение 20 мин при охлаждении.

У

Полученный буферный экстракт, содержащий 360 мг белка в 100 мл 30

0,01 И трис-НС1 буфера рН 8,0, использовали в реакции биосинтеза простагландинов.

Н р и м е р 2. К 12,4 мг арами. доновой кислоты (953 чистоты) IIpH» бавляют 360 мл белка актиномицета

Str.sphегоides в 100 мл. трис-НС1 буфера рН 8,0; 5,7 мг гидрохинона. Через раствор пропускают воздух при

37 ф 0,5 С в течение 7 мин, затем 4 добавляют этиловый спирт в соотиоше- нии 1:7 (Ч)Ч), экстрагируют простагландины этилацетатом, хроматогра- фируют на коЯонках с кремниевой кислотой ГОСТ 4214-70, вымывая проста- 45 гландины 157-ным метанолом в этилацетате. Получают 3,75 мг ПГРз, 1 мг

ПГЕз, 0,5 мг ПГА 0,3 мг ПГВ

Анализ простагландинов.

УФ-спектроскопия. Образец ПГ растворяют в этиловом спирте и снимают

50 спектр в УФ-област. света. Имеется поглощение при Лщ „ 224 нм и 280 мм, что соответствует простагландинам групп А и В. Образец ПГ изомеризуют в щелочной среде по известной методи5S ке, снимают УФ-спектр — имеется поглощение при A „„, 280 нм, что соответствует ПГЕ>, 4

К 0,02 г образца добавляют 2 мл концентрированной серной кислоты и оставляют при комнатной температуре на 2-3 ч. Затем добавляют 2 мл спирта и снимают спектр в Уф и видимой области света 210 — 540 нм. Имеется поглощение при „ 304, 330, 465 и

528 нм, что. соответствует простагландинам группы F и при Д „„ 354, 365, 452, 477 нм, что соответствует

ПГЕ з.

Тонкослойная хроматография. Выполняют на пластинках "Si1Ufol" со свидетелями ПГ фирмы "Serve" в системах:

1. хлороформ — метанол — уксусная кислота — вода (90:8:1:0,8) Rf ПГУ, 0 18-0,20

ПГЕп 0,38-0,40

ПГАз + ПГВ5 0,6-0,55

2. бензол — диоксан — уксусная кислота (20: 20: 1) 3. серный эфир — метанол — уксусная кислота (90:1:2) Биотестирование образцов ПГ осуществлялн на полоске матки или кишки крысы, наблюдая увеличение амплитуды сокращения и учащение ритма.

Радиоизотопный метод. Для тести« рования образования ПГ использовалась арахидоновая кислбта меченная по углероду, с последующей тонкослойной хроматографией. Идентифицированы

ПГР (, ПГЕ, ПГАз + ПГВз.

Предлагаемый способ обеспечивает более высокий выход ПГ.

Формула и з о б р е т е н и я

Способ получения простагландинов, включающий ферментативную конверсию арахидоновой кислоты с последующей экстракцией органическим растворите,пем н хроматографическнм выделением продукта, о т л,и ч а ю шийся тем, что, с целью повЬппения выхода продукта, в качестве ферментного препарата используют экстракт Streptomyces sphегоides ВКПМ S-573, про1497185 6 дом колоночной хроматографии на кремниевой кислоте ° дукт экстрагируют этилацетатом » а выделение и очистку выполняют метоСоставитель А.Семенов

Техред М.Дидык Корректор М.Демчик

Редактор М.Келемеш

Тираж 352

Заказ 4402/28

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035» Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101