Способ исследования окислительного цикла "глюкоза/жирные кислоты" в тканях организма

 

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для выявления окислительного цикла "глюкоза/жирные кислоты" в тканях организма животных. Цель - повышение точности способа. Способ заключается в том, что в качестве модулятора окисления глюкозы и жирных кислот используют 2-метил-3-пиперидинометил-1,4 нафтохинон, а о наличии окислительного цикла глюкозы и жирных кислот в тканях организма животных судят по реципрокному характеру сдвига окисления глюкозы и жирных кислот. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (191 (111 (11 4 С 01 N 33/66

" и СВЛ43

РА > ЕНЦ„1 у 1. ц

Ьa,ßÄ

: г(,4

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫ7ИЯМ

ГМ И ГННТ СССР (21) 4238721/28-14 (22) 29.04.87 ,(46) 30.08.89. Бюл. Ф 32 (71) Латвийский научно-исследовательский институт экспериментальной и клинической медицины и Латвийский государственный университет им.

П.Стучки (72) К.-О.К.Хейдемаиис, Я.Я.Дрегерис и И.О.Ауэиия (53) 612.015 (088.8) (56) Siochem.. J., 1985, v. 232, Ф 2, с ° 585-591 °

Изобретение относится к экспериментальной медицине.

Целью изобретения является повышение точности способа при исследовании in vitro.

Согласно предлагаемому способу в качестве модулятора окисления глюкозы и жирных кислот используют .2-ме" тип"З-пиперидинометил-1,4 нафтохи- и нон (А).

По реципрокному характеру сдвига окисления глюкозы и..жирных кислот судят о наличии окислительного цикла

"глюкоза/жирные кислоты" в тканях организма животных.

Способ поясняется примерами.

Пример 1. Выявление метабо1 лического цикла "глюкоза/жирные кис2 (54) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ ОКИСЛИТЕЛЬ=

НОГО ЦИКЛА ГЛЮКОЗА/Л61РНЪ(Е КИСЛОТЫ"

В ТКАНЯХ ОРГАНИЗМА (57) Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для выявления окислительного цикла "глюкоза/жирные кислоты" в тканях организма животных. Цель— повышение точности способа. Способ заключается в том, что в качестве модулятора окисления глюкозы и жирных кислот используют 2-метил-3-пиперидинометил-1,4-нафтохинон, а о наличии окислительного цикла глюкозы и жирных кислот в тканях организма животных судят по реципрокному характеру сдвига окисления глюкозы и жирных кислот ° 2 табл. лоты" в изолированных тромбоцитах человека.

Тромбоциты изолируют из неноэной крови человека с помощью дифференциального центрифугирования и суспендируют в буферном растворе Кребс-Рин- © гера (рН 7,4) с добавлением глюкозы (©

1 г/л, при этом в 1,0 мя суспензии содержится 0,95 мг белка. 1,5 кп суспензии тромбоцитов вливают в конические сосуды, в центре которых расположен цилиндр, в который вкладывают кисточки из фильтровальной бумаги для связывания выделяемого СО (киси точку предварительно смачинают раствором гайамина). Число контрольных и опытных образцов - no 5 штук в каждой серии. K контрольным образцам

3 1504598 4 добавляют физиологический раствор, к

14

С0, флаконы вновь плотно эакрываопытным — раствор соединения А до ют и инкубируют в течение 30 мин, концентрации 1 мкмоль/л. Затем в каж извлекают фильтровальную бумагу, выдый сосуд добавляют по 10 мкл мечено- сушивают и помещают ее во флаконы со

ro субстрата; содержащего 37 кБк сцинтилляционной жидкостью Ж-106 для (4, (1 мкКи) радиоактивной метки: 1- С измерения радиоактивности. глюкозы или 1 в С пальмитоил-СоА. Со14

Результаты измерений (число имсуды плотно закрывают и инкубируют пульсов эа 1 мин) выражают в пикомоо при 37 С в течение 60 мин. Затем в <р лях (пмоль) субстрата, окисляемого каждый сосуд вливают по 0,2 мп кон.- в течение 1 ч в тромбоцитах (1 мг центрированной перхлорной кислоты для белка) и обрабатывают статистически. высвобождения иэ инкубационной смеси Данные приведены в табл ° 1..

Таблица 1

Эффект воздействия пмоль/ч/мг

Мод улят ор

М

1- С пальмитоил СоА

44, 1- С глюкоза

Фи э и ол огич ес- . кий р-р 59,4 + 7,3

Соединение А 116,1 + 12,5

6,68 + 0,29

4,42 + 0)45 Из табл. 1 видно, что под влиянием воздействия соединения А in vitro наступает увеличение окисления глю- 30 козы (195,5Х контрольного показателя) и снижение окисления пальмитиновой кислоты (66,2X контрольного показателя), т. е. торможение окисления жирных кислот сопровождается увеличением окисления глюкозы, что указывает на окислительный цикл "глюкоза/жирные кислоты" в тромбоцитах человека.

Пример 2. Выявление окислительного цикла глюкоза/жирные кис- 4р лоты" в скелетной мьппце диабетических крыс после введения им соединения А.

Диабет вызывают у крыс линии Вистар путем однократного введения ал- 45 локсана в дозе 15 мг/кг внутрибрюшинно. На 7-й день после введения проводят определение концентрации глюкозы в крови и отбирают животных, у которых этот показатель превышает

200 мг/100 мл крови. Дальнейшие наблюдения проводят над тремя группами крыс. Контрольной группе диабетичес-.. ких крыс вводят физиологический раствор под кожу в течение 10 дней, опытной группе диабетических крыс вместо физиологического раствора ежедневно вводят под кожу соединение А в дозе

0,3 мг/кг веса (при идеальном равномерном распределении такая доза должна бы создать микромолярную концентрацию соединения А в организме животного). Третья группа крыс — интактные животные. На 10-й день крысам дают гексеналовый наркоз (40 мг/кг массы тела) внутрибрюшинно, вскрывают грудную клету, из сердца шприцем отсасывают по воэможности всю кровь, затем берут навески иэ скелетной мышцы (мышцы бедра), с помощью стеклянного гомогениэатора готовят !

10Х-ный гомогенат в буфере Кребс-Рингера (рН 7,4), содержащем хлористый магний в концентрации 2 мМ/л и глюкозу (1 г/л). В качестве субстратов окисления используют 1- С пальмитиA новую кислоту (в комплексе с альбумином) и 1- С глюкозу. Окисление субстратов проводят по методу, описанному в гримере 1, но в качестве показателя окисления пальмитиновой кислоты используют количественные сдвиги меченой кислоты в инкубационной смеси. Для этой цели после добавления перхлорной кислоты для ос" тановкн реакции окисления инкубационную смесь нейтрализуют раствором гидроокиси натрия, проводят экстракцию липидов и разделение их в тонком слое силикагеля. Хроматограммы проявляют в парах йода, полосы, соответст-

5 1504598 6 вующие фракции жирных кислот, соскаб- Результаты измерений выражают в ливают в счетные флаконы для измере- пикомолях меченого соединения, окисния радиоактивности, используя жидкий ляемого за 1 ч, в. пересчете на 1 г толуоловый сцинтиллятор ЖС-106. мышцы. Результаты приведены в табл. 2.

Та блица 2

Образование СО (Ф, из 1- С глюкозы, пмоль/г мышцы

Группы крыс, вводимое соединение

Количество

1- С паль14 митиновой кислоты в инкубационной смеси, пмоль/г мышцы

317 + 23

62,8 4,9

Диабетические, физиологический

P P

Диабетические, соединение А

Интактные

252 + 18

257 + 15

43,3 р 6>7

76,0 + 9,5

Формула изобретения

Составитель В. Галкина

Техред М.Дидык Корректор M.Ïoæo

Редактор Л.Веселовская

Заказ 5247/46 Тираж 789 Подписное

ВЙИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101

Как видно иэ табл. 2, введение соединения А крысам с аллоксановым диабетом сопровождается усилением окисления пальмитиновой кислоты и снижением окисления глюкозы мьппечной тканью: количество rальмитиновой кислоты в инкубационной смеси уменьшается на 20,6Х по сравнению с контролем, что свидетельствует об увеличении ее использования, однако окисление глюкозы под влиянием воздействия соединения А составляет лишь

68,9Х контрольного показателя. Это указывает на осуществление окислительного цикла глюкоза/жирные кисло(! 40 ты" в скелетной мышце диабетических крыс.

Способ исследования окислитель( (1 Р ного цикла глюкоза/мирные кислоты в тканях организма путем введения радиоактивно меченного субстрата с последующей регистрацией реципрокного сдвига окисления глюкозы и жирных кислот, отличающийся тем, что, с целью повьппения точности способа, при исследовании in vitro, предварительно перед введением субстрата вводят 2-метил-3-пиперидинометил-1,4-нафтохинон в концентрации

10- М.