Способ получения карбоксипептидазы а из поджелудочной железы свиньи

 

Изобретение относится к способу получения ферментного препарата карбоксипептидазы A (КПА) из поджелудочной железы свиньи, применяемого в белковой химии для структурных исследований. Цель изобретения - повышение активности целевого продукта и упрощение процесса. КПА получают экстракцией сырья 0,005 М трис-HCL буфером при рН 7,5-7,6. Из полученного экстракта сульфатом аммония при насыщении 0,64-0,66 и рН 7,5-7,6 выделяют белковую фракцию, содержащую целевой продукт. Очистку КПА осуществляют двукратной ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, уравновешенной 0,005 М трис-HCL буфером при рН 7,5-7,6. Кристаллизуют из воды. Удельная активность КПА 29,7-32,5 ед/мг белка. Выход по активности 31,5-32%.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

А1 (19) (И) (51) 4 С 12 N 9/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР

1 (21) 4344215/28-13 (22) 15.12.87 (46) 23.11.89. Бюл. Г 43 (71) Научно-производственное объединение "Биолар" и Латвийский государственный университет им.П.Стучки (72) Д.Н.Иенес, А.А.Иарнауза, А.Х.Швагере, Д.A.Клявиня, Т,ф.фридман и M.Ï.Ïóòåðå (53) 577.15 (088.8) (6) Biochemistry, 1965, v.4, и 9, р.1750-1757.

of Biol. chem., 1963, v. 238

И 12, р. 3384-3894. (Я4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ А ИЗ ПОД>1ЕЛУДОЧНОД ИЕЛЕЗЫ СВИНЬИ (7) Изобретение относится к способу получения ферментного препарата карИзобретение относится к способам получения ферментных препаратов, а именно карбоксипептидазы А.

Цель изобретения - повышение активности целевого продукта и упрощение процесса.

Изобретение заключается в том, что экстракцию сырья (ацетоновый порошок поджелудочной железы свиньи) проводят 0,005 М трис-НС1 буфером при рН 7,5-7,6, из полученного экстракта сульфатом аммония при насыщении

0,64-0,66 и рН 7,5-7,6 выделяют белковую фракцию, содержащую целевой продукт, а очистку KllA осуществляют двукратной ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, уразновешенной 0,005 И трис-НС1 буфером при рН

2 боксипептидазы А (КПА) из поджелудочйой железы свиньи, применяемой в белковой химии для структурных исследований. Цель изобретения — повышение активности целевого продукта и упрощение процесса. КПА получают экстракцией сырья 0,005 М трис-НС1 буфером при рН 7,5-7,6. Из полученного экстракта сульфатом аммония при насыщении

0,64-0,66 и рН 7,5-7,6 выделяют белковую фракцию, содержащую целевой продукт. Очистку КПА осуществляют двукратной ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, уравновешенной 0,005 М трис-НС1 буфером при рН

7,5-7,6. Кристаллизуют из воды.Удельная активность КПА 29,7-32,5 ед/мг белка. Выход по активности 31,5-324.

7,5-7,6)и кристаллизуют фермент из © . воды, hD

Пример 1. 0,7 кг свежезаморо- CA женных поджелудочных желез свиньи Ql разрезают на кусочки 4-6 мм и остав- ) ляют для автолиза при комнатной тем- ( пературе на 24 ч. Полученную массу обрабатывают 4 раза ацетоном, затем смесью ацетона и эфира (в соотношении

1:1) и эфиром при интенсивном перемешивании в течение 1 мин, высушивают при комнатной температуре. Получают

140 г ацетонового порошка °

Ацетоновый порошок перед экстракцией размельчают в лабораторной мельнице. 140 г ацетонового порошка размешивают с 1400 мл 0,005 И трис-НС1 буфера с рН 7,5 в течение 45 мин на

1523570 4 магнитной мешалке при комнатной температуре. Осадок отделяют центрифугированием при 6000 об/мин в течение

60 мин при 4 С. Получают 1300 мл экстракта. рН экстракта доводят до рН

7,5 с помощью 1 М раствора NaOH.

К экстракту по порциям добавляют сульфат аммония до 0,64 насыщения, поддерживая рН 7,5. Перемешивают

30 мин. -Выпавшую белковую фракцию от- . деляют центрифугированием при

6000 об/мин в течение 40 мин и 3 С,". суспендируот в 360 мл 0,05 И трис-ЙС1 буфера и подвергают диализу против 15

0,005 И трис-НС1 буфера с рН 7,5 до отсутствия сульфата аммония. Осадок, выпавший во время диализа, отделяют центрифуги@ованием в течение. 30 :мин . при 6000 о6 /мин и 4 С и отбрасывают. 20

Центрифугат используют для дальнейшей очистки.

Хроматография проводится при 4.С.

На колойку размером бх25 см, заполйен- 5 ную ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной

0,005 И трис-НС1 буфером с рН 7,5 . наносят 400 мл раствора белка, полученного на стадии Ш со скоростью течения 30-40 мл/ч. Через колонку пропускают 5 л 0,005 М трис-НС1 буФерного раствора с рН 7,5 для удаления неадсорбированных белков. КПА . элюируют линейным градиентом концент: рации: в одном сосуде 1 л 0,005 И трис-НС1 буфера с рН 7,5, в. другом

1 л 0,3 М натрия хлористого в 0,005 И трис-НС1 буфере с рН 7,5. Объединяют фракции с удельной активностью КПА не менее 12 ед/мг белка. К объединен ным фракциям с активностью КПА добав- 40 .ляют сульфат аммоний до 0,64 насыще ния и перемешивают 30 мин, Осадок отделяют. центрифугированием в течение

1.ч при 6000 об./мин и.4 С и раство-. ряют в 45.мл 0,05. М трис-НС1 буфера . c рН 7 5.: Осадок, выпавший во .время диализа, отделяют центрифугированием и выбрасывают. Центрифугат в количестве 50 мл наносят на колонку разме.ром 2,9х25 см, заполненную ДЗАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 И трисНС1 буфером с рН 7,5. Скорость течения через колонку 30-40 мл/ч. Через колонку пропускают 1 л 0,005 И трисНС1 буфера с рН 7,5 для удаления побочных продуктов. Карбоксипептидазу

А элюируют линейным градиентом концентрации: в одном сосуде 1 л 0,005 И трис-НС1 буфера с рН 7,5, а в другом

1 л 0,3 М натрия хлористого в 0,005 И трис-HCl буфере с рН 7,5. Объединяют фракции с удельной активностью. КПА не менее 16 ед/мг белка.

К элюату медленно по порциям добавляют сульфат аммония до 0,64 насыщения и перемешивают 30 мин. Осадок отделяют центрифугированием при

6000 об, /мин в течение 50 мин при

4 С, растворяют в 20 мл 0,05 M трисНС1 буфера с рН 7,5 и диализуют против 0,005 М трис"НС1 буфера с рН 7,5.

Осадок отделяют центрифугированием и выбрасывают..

Полученный раствор КПА в 0,005 И трис-HC3 буфере с рН 7,5 диализуют против воды для кристаллизации КПА.

Выпавшие кристаллы промывают два раза водой, а:затем растворяют при рН 6,8 (рН доводится гидроокисью натрия) и отделяю нерастворившиеся примеси центрифугированием йри 150000 об /мин в течение 3О мин. Полученйый раствор

КПА диализуют против воды для перекристаллизации КПА. В образовавшуюся суспензию кристаллов добавляют 4ъ толуола .(от объема суспензии).

Удельная активность 29,7 ед./мг белка; выход по активности 32В.

Пример 2, Приготовление ацетонового порошка аналогично примеру. 1.

140 r. измельченного ацетонового порошка размешивают с 1400 мл 0,005 И трис-.НС1 буфера с рН 7,5. Осадок отделяют центрифугированием. Получают

1350 мл экстракта. рН экстракта доводят до 7,55 1 М раствором NaOH.

К экстракту на холоду при 40 С добавляют сульфат аммония до 0,65 насыщения при рН до 57,55. После центрифугирования выпавшую белковую фракцию суспендируют в 0,05 М трис-НС1 буфере с рИ 7,55 и. подвергают диализу против 0,005 М трис-НС1 буфера с рН

7,55 до отсутствия сульфата аммония.

Диализат от стадии III наносят на колоНку бх20 см, заполненную ДЗАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 И трисНС1 буфером 7,55. После отмывки колонки тем же буфером от неадсорбированных белков КПА элюируют линейным градиентом концентрации: s одном сосуде

1 л 0,005 М трис-НС1 буфера с рН 7,55, а в другом .1 л 0,3 И натрия хлористого в 0,005 М трис-НС1 буфере с рН 7,55.

Объединяют фракцию с активностью КПА не менее 13 ед./мг белка. КПА из элю5 152357 ата осаждают сульфатом аммония при

0,60 насыщении и рН 7,55, осадок отделяют центрифугированием, суспендируют в 0,05 И трис-НСI буфере с рН

7,55 и освобождают от солей диализом против 0,005 И трис"НСI буфера с рН

7,55. Получают 45 мл диализата. Для дальнейшей очистки диализат наносят на колонку 2,9х20 см, заполненную

ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной

0,005 И трис-НС1 буфером с рН 7,55.

После промывки колонки этим же буфером КПА элюируют линейным градиентом концентрации: в одном сосуде 1 л

0,005 И трис-НСI буфера с рН 7,55, а в другом 1 л 0,3 М натрия хлористого в 0,005 М трис-HCl буфере с рН

7,55. Объединяют фракции, имеющие активность карбоксипептидазы А не ме- 20 нее 16 ед./мг белка. Из объединенной фракции сульфатом аммония при насыщении 0,65 М и рН 7,55 осаждают КПА.

Осадок суспендируют в 20 мл 0,05 И трис-НС1 буфера с рН 7,55 и освобождают от сульфата аммония диализом против 0,005 М трис-НСI буфера.

Полученный раствор КПА в 0,005 М трис-НСI буфере с рН 7,55 диализуют против воды для кристаллизации KllA.

Выпавшие в процессе диализа кристаллы промываю два раза водой, а затем

pBcTBopRot при рН 0,8 (рН доводится гидроокисью натрия) и отделяют нерастворившиеся примеси центрифугирова- . нием. Полученный раствор КПА диализу- З5 ют против воды для перекристаллизации КПА. В образовавшуюся суспензию кристаллов добавляют 4,5 > толуола.

Удельная активность 32,5 ед./мг белка; выход по активности 31,54.

Пример 3. Ацетоновый порошок из поджелудочной железы свиньи приготавливают аналогично примеру 1.

140 г измельченного ацетонового порошка экстрагируют 1400 мл 0,005 И

45 трис-НСI буфера 7,6, После центрифугирования получают 1400 мл экстракта.

К экстракту при 4 С добавляют сульфат аммония до 0 05 насыщенного при рН 7,6. После центрифугирования вы- павшую белковую фракцию суспендируют в 0,05 М трис-НС1 буфере с рН 7,6 и подвергают диализу против 0,005 М трис-НС1 буфера с рН 7,6 до отсутствия аммония.

Диализат от стадии III наносят на колонку бх25 см с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 И трис-НС1 Gy0 6 фером с рН 7,6. После отмывки колонки тем же буфером КПА элюируют линейным градиентом концентрации: в одном сосуде 1 л 0,005 М трис-НСI буфера с рН 7,6, а в другом 1 л 0,3 М 1ХаС1 в 0,005 И трис-НС1 буфере с рН 7,5, объединяются фракции с удельной активностью КПА не менее 12 ед./мг. Из полученной фракции КПА, освобожденную от основной массы побочных белков, осаждают сульфатом аммония при 0,66 насыщении и рН 7,6. Выпавший осадок

КПА отделяют центрифугированием, суспендируют в 0,05 М трис-НС1 буфере с рН 7,6 и освобождают от солей диализом против 0,005 М трис-НС1 буфера с рН 7,6. Получают 50 мл диализата.

Для дальнейшей очистки диализат наносят на колонку 2,9х25 см с ДЭАЭ" целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС1 буфером с рН 7,6. Колонку промывают тем же буфером, а элюирование КПА проводят градиентом концентрацией 0,3 M натрия хлористого в

0,005 И трис-HCI буфере с рН 7,6.

Объединяются фракции с удельной активностью КПА не менее 16 ед./мг белка. Из объединенной фракции сульфат аммония при насыщении 0,66 и рН 7,6 осаждают КПР. Осадок суспендируют в 20 мл 0,05 И трис-НС1 буфера рН

7,6, диализуют против 0,005 М трис"

НС1 буфера с рН 7,6 до отсутствия сульфата аммония.

Полученный раствор КПА в 0,005 М трис-НС1 буфере с рН 7,6 диализуют против воды для кристаллизации КПА.

Выпавшие кристаллы промывают два раза водой и затем растворяют при рН 6,8 (рН доводится гидроокисью натрия) и отделяют нерастворившиеся примеси центрифугированием. Полученный раствор КПА диализуют против воды для перекристаллизации КПА. В полученную суспензию кристаллов добавляют 5ь толуола.

Удельная активность КПА 30,2 eq./ìã белка; выход по активности 31,8>.

Пример 4. Приготовление ацетонового порошка аналогично примеру 1.

140 г измельченного ацетонового порошка экстрагируют 1400 мл 0,005 M трис"НС1 буфера с рН 7,4. После центрифугирования получают 1300 мл экстракта.

К экстракту при 44 С добавляют сульфат аммония до 0,63 насыщения при рН

7,4. После центрифугирования выпавшую

1523570 белковую Фракцию суспендируют в

0,05 М трис-НС1 буфере с рН 7,4 и подвергают диализу против 0,005 М трис-НС1 буфера с рН 7,4 до отсутствия сульфата аммония.

Диализат на стадии III наносят на колонку бх25 см, заполненную ДЭАЭ, целлюлозой, уравновешенной 0,005 M трис-НС1 буфером с рН 7,4. После отмывки колонки тем же буфером КПА элюируют линейным градиентом концентрации натрия хлористого 0,3 М в

0,005 М трис-НС1 буфере с рН 7,4.

Объединяют Фракции с удельной активностью КПА не менее 12 ед./мг белка.

Из полученной объединенной фракции

КПА осаждают сульфатом аммония при

0,3 насыщении и рН 7,4. Выпавший осадок КПА отделяют центрифугированием, после чего суспендируют в 0,05 М трис-НС1 буфере с рН 7,6 и освобожда" ют от солей диализом против 0,005 М трис-НС1 буфера с рН 7,4. Получают

45 мл диализата. 25

Полученный диализат наносят на колонку 2,9х25 см с ДЭАЭ-целлюлозой уравновешенной 0,005 М трис-НС1 буфером с рН 7,4. Колонку промывают тем же буфером, а элюирование КПА проводят градиентом концентрации

0,3 M. натрия хлористого в 0,005 М трис-НС1 буфере с рН 7,4. Объединя" ются фракции с удельной активностью

КПЯ не менее 16 ед./мг белка, Из объединенной фракции сульфатом аммония при насыщении 0,63 и рН 7,4 осаждают КПА. Осадок суспендируют в

20 мл 0,05 M трис-НС1 буфера с рН

7,4, диализуют против 0,005 М трис- 40

НС1 буфера с рН 7,4 до отсутствия сульфата аммония.

Полученный раствор КПА в 0,005 М трис-НС1 буфере с рН 7,4 диализуют против воды для кристаллизации КПА.

Выпавшие кристаллы промывают два раза водой и затем растворяют при рН 6,8 и отделяют нерастворившиеся примеси центрифугированием. Раствор КПА диа" лизуют против воды для перекристаллизации KllA. В полученную суспензию кристаллов добавляют 34 толуола.

Удельная активность КПА 20 ед./мг белка, выход 254.

Пример 5. Приготовление аце" тонового порошка аналогично npwepy 1.55

140 r измельченного ацетонового порошка экстрагируют 1400 мл 0,005 М трис-НС1 буфера с рН 7,7, После центрифугирования получают 1350 мл экстракта.

К экстракту при 4 С добавляют сульфат аммония до 0,67 насыщения при рН

7,7. После центрифугирования выпав" шую белковую фракцию суспендируют в

0,005 M трис-НС1 буфере с рН 7,7 и подвергают диализу против 0,005 М трис"НС1 буфера с рН 7,7 до отсутствия сульфата аммония.

Диализат от стадии III наносят на колонку бх25 см с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС1 буфером с рН 7,7. После отмывки колонки тем же буфером КПА злюируют линейным градиентом концентрацией 0,3 M натрия хлористого в 0,005 М трис-НС1 буфера рН 7,7. Объединяются фракции с удельной активностью КПА не менее

12 ед./мг белка.

Из полученной Фракции КПА осаждают сульфатом аммония при 0,67 насыщении и рН 7,7. Выпавший осадок КПА отделяют центрифугированием, суспендируют в 0,05 М трис-НС1 буфере с рН 7,7 и освобождают от солей диализом против 0,005 t1 трис-НС1 буфера с рН 7,7.

Получают 52 мл диализата.

Для дальнейшей очистки диализат наносят на колонку 2,9х25 см с ДЭАЭцеллюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС1 буфером с рН 7,7. Колонку промывают тем же буфером, а элюирование КПА проводят линейным градиентом концентрацией 0,3 М натрия хлористого в 0,005 М трис"НС1 буфере с рН 7,7.

Объединяют Фракции с удельной активностью КПА не менее 16 ед./мг белка.

Из объединенной фракции сульфатом аммония при насыщении 0,67 и рН 7,7 осаждают КПА. Осадок суспендируют в 20 мл 0,005 М трис-НС1 буфера с рН

7,7 и диализуют против 0,005 М трисНС1 буфера с рН 7,7 до отсутствия сульфата аммония.

Полученный раствор КПА в 0,005 М трис-буфере с рН 7,7 диализуют против воды кристаллизацией КПА. Выпавшие кристаллы промывают два раза водой и затем растворяют при рН 6,8 и отделяют нерастворившиеся примеси центрифугированием. Полученный раствор КПА диализуют против воды для перекрис" таллизации, В полученную суспензию кристаллов КПА добавляют 6 толуола.

Удельная активность КПА 22,6 ед./мг белка; выход 28,11.

l0

Составитель A.Ïóãà÷

Редактор Н.Яцола Техред JI.Ñåðäþêîâà

Корректор М.Васильева

Заказ 7007/26 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, К-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r Ужгород, ул. Гагарина, 191

9 15235

Таким образом, технико-экономический эффект предлагаемого способа заключается в улучшении качества ферментного препарата карбоксипептидазы

А, применяемой в белковой химии для структурных исследований, а также в упрощении технологического процесса за счет сокращения числа стадий.

Формула изобретения

Способ получения карбоксипептидазы А из поджелудочной железы свиньи, включающий экстракцию ацетонового порошка трис-НС1 буфером, осаждение

15 фермента сульфатом аммония, двукратную ионообменную хроматографию на

ДЭАЭ-целлюлозе в- 0,005 М трис-НС1 буфере с градиентной элюцией хлористым натрием и последующей кристаллизацией из воды, о т л и ч а ю щ,и йс я тем, что, с целью повышения ак" тивности целевого продукта и упрощения процесса, экстракцию, осаждение

Фермента и хроматографию ведут в

0,005 М трис-HCl буфере рН 7,5-7,6, осаждение проводят при насыщении сульфата аммония 0,64-0,66, а элюцию с ДЭАЭ-целлюлозы ведут градиентом хлористого натрия 0-0,30 М.