Способ выделения лейцинаминопептидазы

 

СПОСОБ ВВДЕЛЕНИЯ ЛЕЙЦИНАМИНОПЕПТИДАЗЫ из биологических жидкостей , предусматривающий нанесение пробы жидкости на хроматографическую колонку, заполненную сорбентом, с последующим элюированием целевого продукта , отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве исходного сырья используют биологические жидкости больных с демиелинизирующими заболеваниями, в качестве сорбента используют сефадекс G-75, промывают колонку физиологическим раствором и вьщерживают сорбированный на сефадексе фермент 3-4 сут, а целевой продукт элюируют физиологическим раствором.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

Э

РЕСПУБЛИК

С 12 N 9/48; А 61 К 37/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3581801/28-13 (22) 28.03.83 (46) 23.09.84. Бюл. Р 35 (72) А.П.Хохлов, Т.С.Баскаева, Ю.Н.Савченко и Н.А.Хрусталева (71) 1-й Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени медицинский институт им.И.М.Сеченова (53) 577. 15(088.8) (56) 1 ° Авторское свидетельство СССР

В 975797, кл. С 12 N 9/48, 1980.

2. Патент Японии В 56-6276, кл. С 12 N 9/48, 1981. (54)(57) СПОСОБ ВЦЦЕЛЕНИЯ ЛЕЙЦИНАМИНОПЕПТИДАЗЫ из биологических жидкос„.SU„„1114 99 А тей, предусматривающий нанесение пробы жидкости на хроматографическую колонку, заполненную сорбентом, с последующим элюированием целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве исходного сырья используют биологические жидкости больных с демиелинизирующими заболеваниями, в качестве сорбента используют сефадекс

Q-75, промывают колонку физиологичес" ким раствором и выдерживают сорбированный на сефадексе фермент 3-4 сут, а целевой продукт элюируют физиологическим раствором.

1 11146

Изобретение относится к биохимии и предназначено для получения широко используемого в биологии и медицине фермента лейцинаминопептидазы.

Известен способ получения лейцинаминопептидазы путем микробиологического синтеза с последующей многостадийной очисткой «1 .

Однако данный способ достаточно сложен, требует длительного времени и дорогостоящих реактивов.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ выделения лойцинаминопептидазы из крови убойных животных, заключающийся в нанесении исходной биологической жидкости на хроматографическую колонку, заполненную диэтиламиноэтилцеллюлозой, с последующим элюированием це-, щ левого продукта буферным раствором и диализом элюата,, после чего диализат подвергают повторной хроматографии на колонках с гидроксилапатитом и ДЗАЭ-сефадексом. Степень очистки 2 целевого продукта 5042 раза от исходного С23.

Недостатками известного способа являются его сложность и многостадийность. 30

Цель изобретения — упрощение способа.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу выделения лейцинаминопептидазы;из биологических

35 жидкостей, предусматривающему нанесение пробы жидкости на хроматографическую колонку, заполненную сорбентом, с последующим элюированием целевого продукта, в качестве исходного,, сырья используют биологические жидкости больных с демиелинизирующими заболеваниями, в качестве сорбента используют сефадекс G -75, промывают колонку физиологическим раствором 4> и выдерживают сорбированный на сефадексе фермент 3-4 сут, а целевой продукт элюируют физиологическим раствором.

Способ заключается в проведении всего одной хроматографической стадии и обусловливает достаточно высокую степень очистки, в среднем 5161 раз.

Упрощение способа при сохранении наибольшего эффекта очистки получают при55 использовании сефадекса Я-75.

При применении частиц декстрана с другими размерами пор (6-10, Ь -25, 99 2

9-50) степень очистки ниже. Жесткие условия опыта не позволяют использовать крупнопористые сефадексы.

Оптимальное время инкубации сефадекса с адсорбированным ферментом установлено опытным путем и составляет 3-4 сут. При инкубации сорбированного фермента менее трех суток активность его не определяется или значитепьно снижена, а более четырех суток — активность фермента также низка по отношению к оптимальной, которая достигается при инкубации в течение

3-4 сут.

Упрощенное получение фермента объясняется следующими причинами. В биологических жидкостях у больных с демиелинизирующими заболеваниями основная масса фермента лейцинаминопептидазы связана с ингибитором. Ингибитор имеет повышенное сродство к соединениям типа дектрана и мол. вес в пределах 20000-50000, поэтому он адсорбируется на колонке с размером частиц, соответствующим сефадексу

Q 75, тогда как связанный фермент имеет мол. вес 150000 и в поры сефадекса ч -75 не проникает. Инкубация в течение указанного времени приводит к отделению фермента от ингибитора, после чего фермент элюируют физиологическим раствором. Ингибитор остается на колонке и может быть использован для реохроматографии.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Биологическую жидкость (сыворотка, кровь, ликвор, моча) наносят на хроматографическую колонку с приспособлениями для центрифугирования, заполненную предварительно отцентрифугированным сефадексом lj -75, центрифугируют в течение 2 мин со скоростью

3000 об/мин, промывают физиологическим раствором для удаления балластных белков и вновь центрифугируют

2 мин со скоростью 3000 об/мин. Колонку инкубируют в течение 3-4 сут при 0-4 C а конечный продукт элюируют физиологическим раствором.

Пример 1. Сыворотку крови больного с рассеянным склерозом наслаивают на хроматографическую колонку (с приспособлениями для центрифугирования), заполненную предварительно отцентрифугиооялнным сефадексом 5-75, центрифугируют 3 мин со скоростью 3000 об/мин> промывают

11146 очист

Сыворотка крови, 50 мп

Доноры

0,0096

0,013

0 05

0,08

20 мл физиологического раствора для удаления балластных белков и вновь центрифугируют 2 мин со скоростью

3000 об/мин. Колонку, содержащую сорбированный фермент, инкубируют в течение 72 ч при 4,0 С, конечный продукт элюируют 5 мл физиологического раствора.

Удельная активность ЛАП до инкубации 0,048 ед/г белка, после инкуба- 1О ции — 250 ед/г белка. Степень очистки 5208 раз.

Пример 2. Метод осуществляют аналогично примеру 1, при этом инкубацию проводят 96 ч. Удельная ак- f5 тивность фермента до инкубации

0,011 ед/г белка, после инкубации

60 ед/г белка. Степень очистки

5454 раза.

Пример 3. У больного с рас- 20 сеянным склерозом берут ликвор, проводят исследования аналогичные примеру 1, инкубацию проводят 84 ч. При этом удельная активность ЛАП до инкубации 0,7 ед/г белка, после инкуба- 25 ции 3910 ед/г белка. Степень очистки 5585 раз.

Пример 4. Исследовали мочу больного рассеянным склерозом. Приемы исследования аналогичны примеру 1, 3fI инкубировали 74 ч. Исходная активность ЛАП нулевая, после инкубации

125 ед/г белка.

Специфическая активность целевого продукта подвергается исследованию его активности с помощью ЛАП-теста фирмы Fermognost.

Метод определения JIAII основан на том, что лейцингидразид под влиянием

ЛАП расщепляется, отщепленный гидра- 4О зин образует с 4-диметиламинобензаль—

99 4 дегидом в солянокислой среде оранжево-красное красящее вещество, которое определяют колориметрически. Испытания проводят в четырех пробирках.

Вначале в пробирки 1 и 2 наливают по

0,5 мл лейцингидразида, выдерживают на водяной бане при 37 С в течение

10 мин, в опытную пробирку добавляют

0,2 мп испытуемой жидкости. Далее все пробирки инкубируют на водяной бане при 37 С 30 мин, после инкубации, в контрольную пробу (пробирка 3) вносят 0,7 мл гидразина, а в пробирку (4 вносят 0,7 мл дистиллированной воды. Затем во все пробирки 1-4 добавляют по 5 мл диметилбензальдегида и быстро перемешивают содержимое пробирок.

Далее в пробирку 2 добавляют 0,2 мл испытуемой жидкости и 30 мин инкубируют при 37аС Не более, чем через

6 ч, изменяют экстинкцию опытной про" бы (пробирка 1) против пустой пробы (пробирка 2) и экстпнкцию контрольной пробы (пробирка 3) против второй пустой пробы (пробирка 4), длина волны

455 мм (можно в области 450-460 нм), ширина слоя 1,00 см. При расчете первое полученное значение экстинкции делят HE второс, активность фермента выражают в единицах (1 ед. — количество ЛАП, которое расщепляет 1 мМоль ;лейцингидразиде в течение 1 мин в условиях одной пробы).

Одновременно в исследуемых образцах проводят количественное определение белка методом Лоури и удельную активность фермента выражают на 1 r белка. Выделение лейцинаминопептидазы из различных биологических жидкостей приведено в таблице.

1114699

3 ) 4

О,!

0,06

791

510

О,1

Миопатия О, 13

Цирроз печени 0,45

Миопатия 0,15

Миопатия О, 1

Радикулоневрит

0,2

0,036

0,12

0,046

Спинальная амистрафия 0,09

0,021

О

Рассеянный склероз О, 1

0,016

0,011

4875

0,05

5454

Миелит острый

0 25

0,048

250

5208

Ликвор, 5 мп

Мо зжечк овый синдром 0,006

1,5

Дискогенный радикулит 0,004

0,05!

1,0

0,0036

Рассеянный склероз 0,004

4687

5585

3750

0,8

3910

0,04

0,7

Моча

25

О!

Цирроз печени

Рассеянный склероз

I о,огз

0,014

0,022 о,оз!

0,109

0,024

0,025

Продолжение таблицы

1 11469.9

Составитель О.Скородумова

Редактор Н.Джуга Техред З.Палий- Корректор И.Муска

Заказ 6735/18 Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4

Данные таблицы показывают, что предлагаемый способ эффективен при использовании биологических жидкостей только от больных демиелиниэирующими заболеваниями. 5 редлагаемый способ значительно упрощен при сохранении высокой степени очистки, позволяет практически использовать биологический материал. взятый у больных с демиелииизирующими заболеваниями, который в настоящее время является отходом после клиникодиагностических исследований.

Преимуществом способа является возможность дальнейшего использования биологических жидкостей после сорбции лейцинаминопептидазы как исходного сырья для получения биологических препаратов.