Способ определения гемолитической активности протеолитических компонентов альтернативного пути комплемента

 

Изобретение относится к области медицины и биологии, в частности к способам определения гемолитической активности протеолитических компонентов альтернативного пути комплемента. Способ обеспечивает повышение точности определения гемолитической активности факторов комплемента за счет исключения искажающих влияний со стороны применяемого реагента. Для этого с помощью ряда измерений скорости лизиса при уменьшающихся концентрациях исследуемого фактора, определяют его пороговое количество, ниже которого лизис эритроцитов не происходит, а затем по зависимости 1/V<SB POS="POST">л</SB> от 1/E-E<SB POS="POST">п</SB>, где V<SB POS="POST">л</SB> - скорость лизиса, определяемая из тангенса угла наклона касательной к кривой лизиса на участке наибольшего наклона, E - общее количество препарата исследуемого фактора, внесенное в инкубационную смесь, E<SB POS="POST">п</SB> - пороговое количество препарата исследуемого фактора, определяют такую эффективную концентрацию фактора, при которой скорость лизиса в данной системе составляет половину от максимальной. Способ может быть применен в научных и клинических исследованиях протеолитических компонентов комплемента, а также в производстве реагентов и препаратов факторов комплемента.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

Al (19) (11) (51) 4 G 01 N 33/53

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4374802/28-14 . (22) 10.02.88 (46) 30.12.89. Бюл. !(48 (71) Ленинградский медицинский институт им. акад. И,П.Павлова (72) И.Г.Щербак, Л.В.Галебская и П.П.Бельтюков (53) 612:118,223-083.337(088.8) (56) Иммунология, 1986, У 3, с. 6669. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕИОЛИТИЧЕСКОИ АКТИВНОСТИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ КОМПОНЕНТОВ АЛЬТЕРНАТИВНОГО ПУТИ КОМПЛЕМЕНТА (57) Изобретение относится к области медицины и биологии, в частности к способам определения гемолитической .активности протеолитических компонентов альтернативного пути комплемента.

Способ обеспечивает повышение точнос" ти определения гемолитической актив.ности факторов комплемента за счет исключения искажающих влияний со стоИзобретение относится к области медицины и биологии, в частности к энэимологии системы комплемента и количественной характеристики биопрепаратов.

Цель изобретения — повышение точности способа.

На фиг.1 представлена зависимость скорости лизиса от количества фактора D в пробе, полученная для разных реагентов; на фиг.2 — зависимость величины обратной скорости лизиса от величины обратной разности общего и по2 роны применяемого реагента. Для этого с помощью ряда измерений скорости лизиса при уменьшающихся концентрациях исследуемого фактора определяют

его пороговое количество, ниже которого лизис эритроцитов не происходит, а затем по зависимости 1/Ч), от l/

/{E-ЕП), где Ч вЂ” скорость лизиса, оп" ределяемая. из тангенса угла наклона касательной к кривой лизиса на участке наибольшего наклона; Š— общее количество препарата исследуемого фактора, внесенное в инкубационную смесь;

Š— пороговое количество препарата

П исследуемого фактора, определяют такую эффективную концентрацию фактора, при которой скорость лиэиса в данной системе составляет половину от максимальной. Способ может быть применен в научных и клинических исследованиях про- С ,теолитических компонентов комплемента, ( а также в производстве реагентов и препа- 2 ратов факторов комплемента. 4 ил.,2 табл, рогового количества фактора Р в пробе, полученная для разных реагентов; на фиг.3 — зависимость скорости лизиса от количества фактора В в пробе, полученная для разных реагентов; на фиг.4 — зависимость величины обратной скорости лизиса от величины обратной разности общего и порогового количества фактора В в пробе, полученная для разных реагентов.

Повышение точности способа достигается эа счет использования зависимости !/Ч от 1/Е-Е>, где Ч„ - ско1532876 рость лизиса эритроцитов, определяемая тангенсом угла наклона касательной к кривой лиэиса на участке наибольшего наклона E — полное количестФ

5 во исследуемого фактора в инкубационной среде; Еп — пороговое количество данного фактора, при котором лиэис эритроцитов в системе еще не происходит.

l0

Учет порогового количества факто ра позволяет получить в указанных координатах прямую, которая пересекает ось абсцисс в точке, соответствующей величине — 1/Км, где К вЂ” эффективное 15

Количество исследуемого фактора в инкубационной среде, при котором скорость лизиса в системе составляет половину от максимально возможной. Величина К в данных координатах одиНакова для всех реагентов, полученных из разных сывороток.

За единицу активности препарата принимают величину, обратную К

Пример 1, Определение гемолитической активности фактора D.

Состав инкубационной среды и порядок смешивания реагентов.

В кварцевые кюветы вносят препарат фактора D (в фосфатном буфере

0,02 М, рН 7,4, приготовленном на

0,15 11 NaC1) в количествах 0,1 0,08;

0,05; 0,02 и 0,0165 мл; фосфатный буфер (0,02 N, рН 7,4, приготовленный на 0,15 И NaC1) в количестве, соответственно 0; 0,02; 0,05; 0,08 или

0,0835 мл, т.е ° дополняющем пробу до

О,1 мл; реагент для определения фактора D, т.е. сыворотку, истощенную по фактору 0 (И2) в количестве 0,2 мп; вероналовый буфер, рН 7,4, содержащий

10 Ai ЭГТА и 0,1Х желатину, в количестве 0,4 мп.

После смешивания перечисленных компонентов кювета прогревается в тече- 45 ние .3 мин при 37 С в проточной термостатируемой ячейке спектрофотометра.

Затем в каждую кювету вносят по О,lмл стандартной суспензии эритроцитов крог лика, приготовленной на вероналовом буфере (рН 7,4), содержащем 0,17. желатины, таким образом, чтобы концентрация клеток в кювете была около

1,2.10 кл/мл. Лизис эритроцитов регистрируется спектрофотометрически

55 при 800 нм. Результаты измерений активности одного и того же препарата

Фактора Р с двумя реагентами по прототипу приведены в табл. 1.

Из полученных данных строят зависимость Ч от E (мл) (фиг. 1), из которых находят пороговые количества фактора (Е„), при добавлении которых в системе еще не происходит лизис эритроцитов. Из приведенных данных

Е для реагента D, составляет

0,012 мл, а для реагента D 0,008 мл (на общий объем инкубационной смеси).

Зависимость 1/Vz от 1/Е нелинейны и не дают воэможности определить величину К

Затем строят зависимость 1/V> от

1/Е-Е (фиг.2), которая линейна и для всех реагентов пересекают ось абсцисс в одной и той же точке, соответствующей величине -1/К = -28 мл

Рассчитывают величину К сначала в мл, а затем, зная общую концентрацию белка в препарате фактора D, в мкг. Она равна 0,036 мл или 3,96 мкг (при концентрации белка в препарате фактора О,ll мг/мл).

Гемолитическую активность исследуемого препарата характеризуют величиной 1/ К, которая составила в данном случае 0,253 ед/мкг.

График на фиг ° 2 позволяет также количественно охарактеризовать реагенты, используемые в опыте, по максимальным скоростям лизиса, которые могут быть достигнуты в системе с применением данного реагента при фиксированной концентрации эритроцитов.

Прямые, полученные для разных реагентов, отсекают на оси ординат отрезки, численно равные l/V z, Таким образом, из полученных данных V„,с,с для

RD, = 5,56 10 кл/мин, à V « для

RD = 6,25 10 кл/мин.

Пример 2. Определение гемолитической активности фактора В.

Состав инкубационной смеси и порядок смешивания реагентов аналогичен примеру 1. Вместо фактора D вносят различные количества фактора В (от

0,01 до 0,06 мл) и соответствующие количества буфера — для доведения объема до 0,1 мл. Затем вносят реагент для определения фактора В (RB) в количестве 0,2 мл. Все остальные действия и расчеты производят аналогично примеру I. Результаты измерений приведены в табл,2 и представлены на фиг.3 и 4.

Из графика на фиг ° 3 определены пороговые количества для каждого реагенТаблица 1

Скорость лизиса, Удельная активность (Ч 10 кл/мин) фактора D (по протоЛ

-6 типу) (А 10 ЛЕК/мкг) Концентрация факто" ра D, мкг/мл

Количество фактора D, Е, мл

0,52

0,55

0,44

0,37

0,33

0,27

0,38

0,40

0,32

0,28

1,16

1,52

3,02

4,05

4,56

0,60

l,04

2,74

3,56

3,85

2,25

2,75

6,88

11,00

l3,75

0,0165

0,02

0,05

0,08

0,10

Т а б л и ц а 2

Концентрация фактора В, мкг/мл

Количест.во фактора В в пробе, Е, мл корость лиэиса, л

10 6 кл/мин

RB RB

RBi

31,8

46,4

42,0

39,7

0 0

0,956 46,3

2,087 56,0

2,52 55,0

3,57 46,3

1,39

2,52

3,304

4,17

0,01

0,02

0,03

0,04

0,06

15328 та. Лля RB, E„=O,OI4 мл, что при кон центрации белка в препарате фактора

В, равной 1,2 мг/мл, .соответствует

16,8 мкг, для КВ Е„=0,016 мл, или

19,2 мкг препарата фактора В в инкубационной смеси. С учетом полученных в каждом опыте пороговых значений количества фактора В построены графики в обратных координатах на фиг.4. 10

Из этого графика находят величину К„„ которая в обоих случаях независимо от реагента составляет 0,013 мл, т.е.

15,6 мкг фактора В. Гемолитическая активность исследуемого препарата фактора В составляет 1:15,6

0,064 ед/мкг. Максимальная скорость лиэиса для реагента RB, 4,76 10 кл/

/мин, для реагента В †.4,17 10 кл/

/мин. 20

Формула изобретения

Способ определения гемолитической активности протеолитических компо- .25 кентов альтернативного пути компле76 6 мента путем измерения скорости лиэиса эритроцитов кролика в присутствии анализируемого фактора и сыворотки крови, истощенной по данному фактору, в качестве реагента, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повышения точности способа, измеряют скорость лиэиса эритроцитов при уменьшающихся концентрациях фактора в системе, определяют пороговое количество фактора, добавление которого в систему еще не вызывает лизиса зритроцитов, а затем строят зависимость

/Чл от 1/Е-Е„, где Чл — скорость лиэиса зритроцитов;

Š— общее количество добавленного в систему препарата исследуемого фактора;

Ед — пороговое количество фактора, и по этой зависимости определяют величину гемолитической активности, соответствующую концентрации исследуемого фактора, при которой скорость лизиса в системе равна половине максимальной.

Удельная активность фактора В (по прототипу), А 10 ЛЕК/мг

1532876 ент бд унт 5{ оов

E (мл) ° Ю (Ь/нияз

t j I ) O ivtw

И-4у(а 9

Составитель Е. Синауридзе

Техред Л.Олийнык Корректор Т,Малец

Редактор О. Спесивых

Заказ 8094/51

Подписное

Тираж 789

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж.-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101