Способ определения нейровирусов в спинномозговой жидкости

 

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике нейроинфекций. Цель - повышение чувствительности способа. Для обнаружения нейровирусов в спинномозговой жидкости используют первичные культуры нейронов спинного и головного мозга эмбрионов крыс, предварительно обработав их средой Игла с PH 6,0-6,5 в течение 30-60 мин. После инкубации в нейронах выявляют антигены вируса иммунопироксидазным методом. Предварительная обработка культур клеток приводит к повышению чувствительности способа на 20%.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4233255/28-14 (22) 20.04.87 (46) 15.12.89, Бюл. У 46 (71) Белорусский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии БССР (72) А.Г. Коломиец, В.И. Вотяков, Н.Д. Коломиец, Б.Я. Вильнер, Г,П. Дубойская, Н.И. Лущицкая и Л.Б. Степанова (53) 612.015 (088.8) (56) Баринский И.@., Щубладус А.К.

Этиология хронических вирусных нейроинфекций. М.: Медицина, 1984.

Изобретение относится к медицине.

Целью изобретения является повы.шение чувствительности способа, Способ осуществляют следующим образом, Для обнаружения вируса использовались первичные культуры нейронов спинного и головного мозга эмбрионов (12-14- и 16-18-суточные, соответственно) крыс, приготовленные следующим образом. Беременные крысы соответствующих сроков беремнности помещались в атмосферу углекислого газа-, наркотизировались и забивались переломом шеи. После извлечения эмбрионов их помещали в раствор Хэнкса, отмывали в нем, затем у эмбрионов вскрывали спинно-мозговой канал или

„„SU„„1529119 A 1 (11 4 r, 01 И 33/53, С 12 Ц 1/06

2 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕЙРОВИРУСПБ

В СПИННО-МОЗГОВОЙ ЖИДКОСТИ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике нейроинфекций. Цель — повышение чувствительности способа. Для обнаружения нейровирусов в спинно-мозговой жидкости используют первичные культуры нейронов спинного и головного мозга эмбрионов крыс, предварительно обработав их средой "Игла" с рН 6,0-6,5 в течение 30-60 мин. После инкубации в нейронах выявляют антигены вируса иммунопироксидазным методом. Предварительная обработка культур клеток приводит к повышению чувствительности способа на 20 . черепную коробку, извлекали спинной или головной мозг. Мозг очищали от оболочек, измельченная мозговая ткань многократно пипетировалась пастеровскими пипетками различных диаметров (от большего к меньшему), В течение

5 мин пробирка со взвесью клеток отстаивалась для осаждения на дно крупных кусочков ткани, супернатант собирался и наносился на покровные стекла, предварительно покрытые коллагеном. Затем культуры помещались в термостат при 37 С. Культивирование вели в чашках Петри.

Исследование спинно-моэ говой жидкости (СМЖ ) на культур» клеток проводили следующим образом„

l 529119

В 10-14-суточных культурах клеток . ростовая среда изымалась и вносилась минимальная среда "Игла" (МЕМ1 с добавлением глюкозы до 600 мг/7. (pH

6,0-6,5) на 1 ч. Затем культуры переносили в ростовую среду (MHM 80%I сыворотка плацентарной крови человека 107; лошадиная сыворотка 107,, глюкоза 600 мг/7.) и добавляли к ней lð

107. СМЖ. Через 1-5 сут. стекла с культурами извлекали из среды роста, промывали 5 мин в физиологическом растворе, .подсушивали феном и фик- . сировали в охлажденном до +4 С ацетона 7 мин. После фиксации стекла отмывали 2 раза по 3 мин в физиологическом растворе и погружали на 10 мин (клетками вверх) в раствор азида натрия (0,001 M ) с добавлением 0,017 р перекиси водорода. Затем стекла с клетками отмывали 3 раза по 10 мин и подсушивали феном. На культуры клеток наносили необходимые кроличьи антисыворотки (к вирусу простого герпеса 25 или приону амиотрофического лейко.спонгиоза) в рабочем разведении 1:50 и помещали во влажную камеру на о

40 мин при 37 С. Затем клетки снова отмывали, и наносили коньюгат (овечьи Зр антикроличьи антитела меченные пероксидазой1 в разведении 1:100. Через

40 мин контакта во влажной камере при 37 С повторяли процедуру отмыво ки, и стекла с исследуемыми культурами клеток погружали в темной камере в раствор субстрата (35 мг 3,3-диаминобензидина в 50 мл физиологического раствора и 0,03% перекиси водорода) на 30 мин. Затем стекла изв- 40 лекали, отмывали, проводили через серию спиртов и ксилол, и заключали в канадский бальзам. Результат учитывали под световым микроскопом, по наличию в зараженных клетках корич-45 нево окрашенных круглых структур, при отсутствии таковых в незараженных клетках.

Для того, чтобы установить опти-. мальные условия для проникновения возбудителей из СКК в клетки был проделан ряд опытов. Культура клеток нейронов обрабатывалась средой с рН

6,0-6,5 в течение 30-60 мин. Это было сделано для изменения проницаемости

55 клеточной мембраны, Пример 1. Исследовали СКК больной К, с подозрением на герпетический энцефалит. Заражали эмбриональную культуру клеток диссоциированных нейронов после обработки ее средой с рН 6,0 в течение 30 мин.

Через 2 сут после заражения в нейронах были выявлены антигены вируса простого герпеса иммунопероксидаэным методом. Диагноз — герпетический энцефалит.

Пример 2. Исследование СМЖ больной Л с подозрением на амиотрофический лейкоспонгиоз, заражали культуру клеток диссоциированных нейронов после обработки их в тече-. ние 40 мин средой с рН 6,0. Через

3 сут после культивирования в клетках был обнаружен антиген возбудителя.

Диагноз — амиотрофический лейкоспонгиоз.

Пример 3. CMK больной Г. с подозрением на амиотрофичеСкий лейкоспонгиоз заразили эмбриональную культуру клеток диссоциированных нейронов после их предварительной обработки средой с рН 6,5 в течение

15 мин. При наблюдении и исследовании этой культуры в течение 2 недель развития вирусной инфекции не установлено.

Предварительная обработка культур клеток диссоциированных нейронов приводит к повышению чувствительности метода — из 53 образцов СМЖ с подозрением на герпетическую инфекцию при использовании предлагаемого способа вирус выявлен в 23 случаях, а по способу-прототипу — в 11 случаях.

Аормулаизобретения

Способ определения нейровирусов в спинно-мозговой жидкости, включающий культивирование вирусов в культуре клеток с последующим иммуноферментным анализом, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве культуры клеток используют первичные диссоциированные нейроны мозга эмбрионов, которые перед определением нейровирусов обрабатывают минимальной средой "Игла" с рН 6,0-6,5 в течение

30-60 мин.