Способ определения противопарагриппозных антител

 

Изобретение относится к биологии и может быть использовано в медицине и ветеринарии для количественного определения противопарагриппозных антител в сыворотках крови человека и животных. Цель изобретения - повышение эффективности способа. Для определения противопарагриппозных антител проводят титрование тест-сыворотки с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием эталонного антивидового конъюгата и нестандартных его серий путем сравнения оптических плотностей продуктов пероксифазной реакции. Затем раствором серной кислоты доводят оптическую плотность до величин плотности в пробах с эталонным конъюгатом и выявленным количеством серной кислоты доводят оптическую плотность до нужной в пробах с исследуемыми сыворотками, содержащими нестандартный конъюгат. Причем эти пробы инкубируют в присутствие кислоты в течение 15 - 30 мин до определения в них оптической плотности. Титр антител определяют в одном разведении по диаграмме зависимости показателя оптической плотности от титра антител. По сравнению с известным способом увеличивается возможность использования для определения противопарагриппозных антител нестандартных конъюгатов на 78%.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) А1 (51)5 G 01 N 33/53

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21 ) 43221 36/28-! 4 (22) 29.! 0.87 (46) 07,01. 90. Бюл. Р 1 (71) Всесоюзный научно-исследовательский и технологический институт биологической промьппленности (72) В.А. Лукина, А.А.11аслак, Н. Н, Быкова и А.А. Бойко (53) 61 5. 2 (088. 8)

1 (56) Маслак А.А., Лукина.B.À. и др.

Передовой научно-производственный опыт в биологической промьппленности, 1987, 1и б. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТИВОПАРАГРИППОЗНЬХ АНТИТЕЛ (57) Изобретение относится к биологии и может быть использовано в медицине и вете рина рин для колич ественно го оп- > ределения противопарагриппозных антител в сыворотках крови человека и животных. Пель изобретения — повьппение эффективности способа. Для определения противопарагриппозных антител

Изобретение относится к биологии и может быть использовано в медицине и ветеринарии для количественного определения противопарагриппозных антител в сыворотках крови человека и животных

Белью изобретения является повьппение эффективности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

2 проводят титрование тест-сыворотки с помощью твердофазного иммунойерментного анализа с использованием эталонного аптивидового конъюгата и нестандартных его серий путем сравнения оптических плотностей продуктов пероксифазной реакции. Затем раствором серной кислоты доводят оптическую плотность до величин плотности в пробах с эталонным конъюгатом и выявленным количеством серной кислоты доводят оптическую плотность до нужной в пробах с исследуемыми сыворотками, содерт:ащим нестандартный конъюгат, При ем эти пробы инкубируют в присутствии кислоты в течение 15-30 мин до определения в них оптической плотности. Титр антител определяют в одном разведении по диаграмме зависимости показателя оптической плотности от титра антител. По сравнению с прототипом увеличивается возможность использования для определения противопарагриппозных антител нестандар:ных конъюгатов на 787..

Вначале оптимизируют условия коли-. чественного определения противопарагриппозных антител в твердофазном иммунофе рментном анализе (ТФИФА) путем полной раститровки тест-сыворотки с 1:400 до 1:409600 с коэффициентом

2, достигая максимально возможную on— тическую плотность продукта пероксидазной реакции при длине волны 490 нм в пределах 1,300-1,400 оптических епи1 534404 ниц для исходного разведения 1:400.

Высокие значения оптической плотности продуктов пероксидазной реакции получают, применяя концентрацию конъюгата, равную 80 нг/лунку, причем в буфер для разведения тест-сыворотки и конъюгата вводят 0,57, альбумина и 0,17. детергента тритона Х-305.

После оптимизации условий количественного определения антител в ТФИФА

1. ля тест-сыворотки, используют аналоичные услов ия для полной рас титров и исследуемых сывороток с разной степенью активности. Затем проводят

1 атематическую обработку результатов

ТФИФА на электронно-вычислительной

Иашине с использованием регрессионно "о и рандомизированного анализов.

При этом исследуемые пробы сыворо- 20

1ок предварительно разводят однократ о (например, 1:3200), вносят одно разведение в лунки сенсибилизированцых парагриппозных антигеном поли—

Qтирольных микроплат, инкубируют с 25 нтителами, мечеными ферментом пероксидазой, выявляют количество связав—

1пегося конъюгата путем добавления раствора субстратной смеси на основе

О-фенилендиамина, корректируют реак— цию но оптической плотности (ОП) тест-сыворотки добавлением в ферментсубстратную смесь раствора с предварительно определенным содержанием ерной кислоты и через 15-25 мин учи35 тывают фотометрически результаты анализа, а количество антител в сыворотКе (титр сыворотки) устанавливают но показателю оптической плотности ОП р

В данном разведении — непосредствен — щ ! но по диаграмме определения титра сыворотки.

Выявляют лунки, в которых после применения той или иной концентрации серной кислоты оптическая плотность повысилась до величин. обозначенных йа диаграмме для данного разведения тест-сыворотки с известным титром .

Затем готовят по одному. разведению исследуемых сывороток, проводят

ТФИФА, усиливают реакцию уже известным количеством серной кислоты, а количество противопарагриппоэных антител определяют в исследуемых сьюорот— ках по диаграмме.

>5

Пример. Проводят полную раститровку исследуемых сывороток. Для

Этого лунки полистирольных микроплат сенсибилизируют раствором антигена («гглютнвируюшие ед. /лунку ) в тече; e 18 ч нри 4 С, после чего микронлаты промывают дистиллированной Во дой, содержащей О, 057. тритона Х-305

В лунки плат, сенсибилиэированных антигеном, вносят но 100 мкл 32 разведенных с l 400 до l 409600 (с коэффициентом 2) исследуемые сыворотки и тест-сыворотки. Микроплаты помешают о на 1 ч при 37 С. Сыворотки разводят эабуферным физиологическим раствором, содержашим 0,5К альбумина и 0,1% тритона Х-305 (ЗФРАТ) . После пятикратного промывания в микроплаты вносят по

100 мкл/лунку антивидового конъюгата в оптимальной концентрации (80 нг/лунку) на ЗФРАТ. За оптимальную концентрацию конъюгата принимается такая концентрация, при которой для тестсистемы в разведении l 400 образуются продукты пероксидаэной реакции с ОП, авной l, 300-1,400. После инкубации о в течение 60 мин при 37 С и заключительного пятикратного промывания в лунки вносят по 100 мкл субстратного раствора . 0,4 мг/мл о-фенилендиамина и 2,4 MN H О в 0,15 К фосфатчо-цитратном буфере рН 5,0. Результаты реакции учитывают при длине волны

490 нм (ОП э ), Ъ спольэуя автоматический считывающий фотометр MP 580 ("Дайнатех ) . Титр сдлвороток (количество противопарагриппоэных антител) определяют методом соотношений (отношение величин ОПдэо положительной (П) и отрицательной (О) сывороток) . Величину П/О выше 2,1 считают положительной ° За титр принимают то ее наибольшее разведение, при котором П/О выше 2,1. С помошью рандомизированного анализа на 3BM CN-4 определяют наиболее информативные разведения, т.е, разведения, которые позволяют с наибольшей вероятностью различать сыворотки с различными титрами.

Далее определяется статическая зависимость показателя ОП (7) от титра сыворотки (Z) и ее разведения (Х).

В результате анализа строят диаграммы для определения титра сыворотки по величине ОП в одном разведении.

Затем определяют количественное содержание противопарагриппозных антител цо одному разведению сыворотки с использованием диаграммы. Для э то го берут тест-сыворотку с титром антител 1:409600 и исследуемые сыворотки, которые разводят однократно, наприВсе сыворотки используют в одном разведении, нап риме р: 1: 3200. Вносят разведенные сыворотки в лунки микроплат — по три лунки на каждую сыворотку. Вносят конъюгат А в разведении, указанном на этикетке. Вносят заранее подобранную усиливающую концентрацию серной кислоты (392 г/л).

Получены следующие результаты: чений Титр сыворотки раз- по показателю ле ОП по диаграм— исло- ме

15344 мер, 113200 (к 3,2 мл ЗФРАТ добавляют 1 мкл сыворотки и тщательно перемешивают) . Вносят в лунки микроплат, заранее сенсибилизированные антигеном, по 1 00 мкл сывороток в одном

5 разведении 1:3200, на каждую сьгворотку используют по три лунки микроплат.

Далее реакцию ТФИФА проводят, как описано вьш е. Учитывают результаты спектрофотометрически и определяют величину ОП в разведении 1:3200 для каждой сыворотки.

В результате установлено, что для

1-й сыворотки величина ОП равна

0,984; 1,000; 1,025. По диаграмме находят титр для этой сыворотки—

1:409600. Для 2-й сыворотки ОП равна

О, 923; 0,879; 1,001, титр по диаграм,ме 1 409600. Для 3-й сыворотки ОП 20

Ор825; 0,890; 0,810, титр по диаграмме 1:204800. Для 4-й сыворотки ОП

0,710; 0,789; 0,753, титр 1:102400.

Для 5-й сыворотки ОП О, 570; О, 653;

0,670, титр 1: 51200. Для 6-й сыворотки ОП О, 525; О, 555; О, 560, титр

1:25600. .Таким образом, используя диаграмму, можно оп реде лить активность сыворотки по одному разведению. 30

Для постановки опыта используют ñóхие конъюгаты в ампулах, которые разводят согласно этикетке, и определяют титры антител по диаграмме, корректируя величину ОП добавлением серной кислоты. Проводят ТФИФА как описано выше, только используют тест-сыворотку и сухие серии конъюгатов разного срока изготовления.

Конъюгат А изготовлен эа полтора 4 года до опыта, конъюгат  — эа 8 мес до опыта, конъюгат С вЂ” за 3 мес до опыта,, конъюгат D — за 20 дней до опыта.

Разводят тест-сыворотку 1:3200 и вносят по 1 00 мкл в 60 лунок микро45 плат, заранее сенсибилизированных ан тигеном. Конъюгаты А, В, С и D разводят согласно рекомендациям на этикетке и вносят по !00 мкл каждой серии

I 50 конъюгата в 15 лунок, Получают следившие показатели ОП:

1 . Средняя из трех зна

ОП для сыворотки в ведении 1:3200 (пос добавления серной к ты) 04 6

Конъюгат

Л О, 134 — О, 150

В О, 160 — О, 180

С О, 200 — О, 240

DО,,360 — О, 4 00

Для корректировки результатов ис1 пользуют растворы серной кислоты ! 9, 6, 98, 1 96, 294 и 392 г/л, которые вносят в три лунки (каждой концентрации) для каждого конъюгата. Реакпию учитывают через 15 мин. Для повышения показателей ОП тест-сыворотки, используемой в разведении

1:3200, до величин ОП 0,920-1,040, соответствующих титру сыворотки

j1: 409600) по диаграмме, потребовалось для конъюгата А внести 50 мкл серной кислоты концентрацией

392 г/л; для конъюгата  — 50 мкл серной кислоты концентрацией 294 г/л; для конъюгата С вЂ” 50 мкл серной кислоты концентрапией 196 г/л; для конъюгата D — 50 мкл серной кислоты концентрацией 98 г/л.

Таким образом, при использовании в ТФИФА конъюгатов разной активности по тест-сыворотке подбирают необходимую концентрацию серной кислоты (19,6-392 r/ë), добавлением которой корректируют оптическую плотность для сыворотки с известным титром.

Затем определяют количественное содержание противопарагриппозных антител в неизвестных сыворотках с использованием конъюгата А и тест-сыворотки. Для этого используют шесть противопарагриппозных сывороток неизвестной активности и одну тест-сыворотку с титром 1:409600 и ОП, например, в разведении 1: 3200, равной

О, 920-1, 040 по диаг рамме, Тест-сыворотка

У 62

О, 998

0,566

1:409600

1: 51200

1534404

Р 26

Р 28

N? 65

В 4

0,512

0,416

1,010

D, 273

1: 25600

1:12800

1:409600

О:6400

Составитель В.Литовченко

Редактор В.Петраш Техред M.Дидык Ко ррек то р С. Шекмар

Заказ 39

Тираж 502

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР ь 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r Ужгород, ул. Гагарина, 101

Сыворотки Ф 26 и 4 подвергаются

Дополнительно полной раститровке в

ТФИФА для подтверждения цифровых показателей данного примера. Оказалось, 10

1 что при полной раститровке титр сыворотки 9 26 равен 1:25600, а титр сыворотки Р 4 равен 1:6400. Таким образом, корректирующие концентрации серной кислоты способствуют повьппе- 15

Нию ОП в ТФИФА, что позволяет по ди- аграмме определить ис тинные титры сыно роток .

C использованием предлагаемого спос оба возможно применение нестандартI

Ных серий антивидового конъюгата. Из

45 серий конъюгата возможно было ис ользовать для выявления противопа- 25

11агриппозных антител все ООЖ этих иберий. По известному способу возможноо использовать с целью выявления йротивопарагриппозных антител только

7 серий из 25, т.е. только 28Х. 30

Формула изобретения

Способ определения противопарагриппозных антител, включающий сенсибилизацию ячеек микропанели антигеном, параллельное внесение в часть из них пробы с тест-сывороткой и проб исследуемых сывороток, инкубацию, добавление эталонного антивидового конъюгата, измерение оптической плотности раствора и определение титра антител по диаграмме зависимости показателя оптической плотности от титра антител, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности способа за счет использования нестандартного конъюгата, перед измерением оптической плотности в пробу с тест-сывороткой и конъюгатом вносят порционно раствор серной кислоты до достижения оптической плотности эталонного конъюгата и далее в пробы с исследуемыми сыворотками и конъюгатом вносят такое же количество серной кислоты и инкубируют в течение 15-30 мии.