Способ определения токсичности химических веществ
Изобретение относится к области контроля за загрязнением окружающей среды и может найти применение в водной токсикологии при медико-биологических исследованиях. Цель изобретения - повышение чувствительности и упрощение технологического процесса. Для этого воздействуют исследуемым веществом на дрожжи, при этом используют штамм. SACCHARAMYCES CORWISIAL 15В=П4, культивирование которого проводят на жидкой питательной среде, содержащей соль двухвалентного железа, с последующим переносом клеток штамма в аэрируемый раствор фосфата калия и выдерживают их в растворе до окисления накопленного дрожжами ферро-железа. После окисления клетки переносят в тестируемый раствор и по степени подавления ферриредуктазной реакции определяют токсичность исследуемого вещества. 1 табл.
СОЮЭ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
А1 щ) О 01 N 33/18, 33/00
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ г.
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЭОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
1 (21) 4382143/30-13 (22) 29,02.88 (46) 15.05.90. Бюл. Р 18 (71) Научно-исследовательский институт биологии при Иркутском государственном университете (72) Л.M.Ковалев, Ю.П.Козлов, М.А;Хабадаева и В,М.Янова (53) 615.9.576.8.097,29(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР
У 1097947, кл. С 01 II 33/18, 1983.
Авторское свидетельство СССР
У 1010557, кл: С 01 И 33/18, 1981, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ
ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ (57) Изобретение относится к области контроля за загрязнением окружающей среды и может найти применение в водной токсикологии при медико-биоИзобретение относится к контролю за загрязнением окружающей среды, может найти применение в водной токсикологии при медико-биологических исследованиях.
Цель изобретения — повышение чувствительности и упрощение технологического процесса.
Для этого клетки штамм Saccharamyces cereyisiae 158-П4, взятые в экспоненциальной фазе роста, переносят в свежую питательную среду, содержащую глюкозу, KH РО, дрожжевой автолизат, 0,5Х желатины и 2 ммоль/л соли Мора (РеБО+" (ИН ) S04 10Н О) . После. 3-часовой инкубации клетки осаждают центрифугированием при 20008, дважды отмывают дистиллированной во2 логических исследования*. Цель изобретения — повышение чувствительности и упрощение технологического процесса. Для этого воздействуют исследуемым веществом на дрожжи, при этом используют штамм Saccharamyces cerevisiae 15В-П4, культивирование которого проводят на жидкой питательной среде, содержащей соль двухвалентного железа, с последующим переносом клеток штамма в аэрируемый раствор фосфата калия и выдерживают их в растворе до окисления накопленного дрожжами ферро-железа. После окисления клетки переносят в тестируемый раствор и по степени подавления ферриредуктазной реакции определяют токсичность исследуемого вещества.
1 табл. дой и вносят в интенсивно аэрируемыи раствор КН PO+ на 1,5 ч для окисления накопленного дрожжами ферро-железа. Затем клетки осаждают и переносят в среду, содержащую КН РО4, и глюкозу (контрольный вариант), а также исследуемое вещество в нужньгх концентрациях (опыт). В начале и в конце 3-часовой инкубации определяют содержание двухвалентного железа в клетках. .Инкубацию проводят в пробирках объемом 10 мл, При этом в контрольном варианте дрржжи восстанавливают аккумулированное железо, в опытном же варианте ферриредуктазная реакция подавляется токсичным веществом в зависимости от его концентрации. По
1564539 снижению скорости восстановления аккумулированного железа судят о токсичности исследуемого вещества.
Содержание двухвалентного железа в клетках определяют следующим образом, Культуральную жидкость центрифугируют при 2000 g. К осадку быстро,. приливают 0,05 М водный раствор
2,2 -дипиридила, тщательно перемеши1 вают, добавляют 10 мМ раствор MgS04 встряхивают, снова центрифугируют при 2000g, К осадку приливают смесь ацетона и 10 мМ раствора MgS04 (1:1, V:Ч), встряхивают, снова центрифугируют. Затем определяют в супернатанте концентрацию (Fe(dipy)> ) + по оптической плотности при 522 ни. Далее рассчитывают скорость восстановления железа как разность концентраций двухвалентного железа в конце и в.начале инкубации, деленная на время инкубации и плотность клеток.
Пример. Влияние нитрита натрия (NaNO<) и Na SiF< (гексафторосиликата натрия) на восстановление железа.
Клетки штамма S, cerevisiae 15В-П4 выращивают на полной жидкой питательной среде, осаждают центрифугированием при 2000g вносят в среду, содержащую 2% глюкозы, 0,2% КН Р04, дрожжевой автолизат (20 мл/л), 0,5% желатины и 2 ммоль/л соли Мора. После 3-часовой инкубации клетки осаждают центрифугированием, дважды отмывают от среды дистиллированной водой, переносят в интенсивно аэрируемый раствор КНдР04 íà 1,5 ч для окисления накопленного дрожжами ферро-железа, После окисления клетки осаждают и вносят в среду, содержащую 0,2%
КН РО и 2% глюкозы — это контрольный вариант, Затем пипеткой разливают культуральную жидкость по 10 мл в стеклянные пробирки, в которые предварительно вносят концентрированные растворы (или навески) NaN0 (в других опытах Na I перемешивают, добавляют 4-5 мл 10 мМ раствора MgS04 встряхивают, снова центрифугируют при 2000g. К осадку приливают 2 мл сиеси ацетона и 10 мМ раствора MgSO> встряхивают, снова центрифугируют. Затем определяют в супернатанте концентрацию (Fe(dipy) )" по оптической плотности при 522 нм. Инкубацию проводят в термостате, при t = 30 С. В конце 3-часовой инкубации определяют содержание двухвалентного железа в клетках. Скорость восстановления железа рассчитывают как разность концентраций двухвалентного железа в. культуре через 3 ч и в начале инкубации, деленная на 180 мин и плотность клеток, В таблице приведена скорость восстановления аккумулированного железа в присутствии токсикантов и в контроле. Нитрит натрия в концентрациях 2 ° 10 4 -5 «10 4 моль/л незначительно, а в концентрации 10" моль/л в 4 раза снижает скорость восстановления жег леза, в концентрации 1,5" 10 M полностью подавляет железо-восстановительный процесс. Гексафторосиликат натрия (Na Способ определения токсичности химических веществ, включающий культивирование штамма Бассharamyces cerevisiae 15В"П4, на жидкой питательной среде воздействие на него исследуемого вещества с последующей оценкой полученных резулЬтатов, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности и упрощения технологии, культивирование штамма проводят на питательной среде, содержащей соль двухванентного железа, затем выделенные клетки инкубируют в аэрируемом растворе фосфата калия до окисления аккумулированного феррожелеза, после этого клетки переносят в тестируемый раствор, а оценку проводят по степени поцавления ферриредуктаэной реакции, 1564539 Токсикант Конце нтр ация токсиканта, моль/л Скорость восстановления железа, нмоль сухой вес, r мин Контроль NaNO Контроль Na S Р6 Составитель С. Пылова Техред Л. Сердюкова Корректор С.Шекмар Редактор Т. Парфенова Заказ 1156 Подписное Тираж 525 ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 2 ° 10 5 ° 10 1,510 5 .10 2 10. 4 10 12,3 10,4 10,0 3,7 8,3 7,7 7,0 4,8 0 5 8,8 7 8 7,7 2,1 8,2 7,4 5,9 4,7 0,5 
