Способ определения антител к вирусу клещевого энцефалита в асцитной жидкости

 

Изобретение относится к медицинской вирусологии, а именно к иммунологическому определению антител к вирусу клещевого энцефалита (КЭ). Цель изобретения - увеличение чувствительности определения субнейтрализующих количеств антител к вирусу КЭ в тесте антителозависимого усиления репликации вируса КЭ. Способ заключается в дополнительной инкубации инфекционных комплексов с антисывороткой. После первого этапа реакции в течение 30 - 90 мин в смесь вирус-антитела добавляют антисыворотку против иммуноглобулинов исследуемого образца в дозе 2 - 8 преципитирующих в реакции диффузионной преципитации в агаре единиц. Определяемые антитела реагируют с вирусом КЭ, а сформированные инфекционные комплексы, несущие иммуноглобулины, с соответствующими антииммуноглобулинами. Сформированные инфекционные комплексы вирус-антитела - иммуноглобулины посредством FC-фрагментов антител из исследуемого образца антииммуноглобулинов взаимодействуют с FC-рецепторами клеток макрофагального ряда U-937. Наличие и титр антител учитывают с помощью иммунофлуоресцентного теста по увеличению числа клеток, содержащих специфический вирусный антиген. Способ позволяет повысить чувствительность по сравнению с прототипом в 100 раз и регистрировать положительную реакцию при разведении иммунного к вирусу КЭ образца 1:10<SP POS="POST">-6</SP>.

СООЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (1)5 .G 01 Я 33/53

В".ЕОЮ

AaTEHT80- T

Б БЛИ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АЬто сноюь СвиДКтеЛьС ГвМ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4415005/28-14 (22) 21.03.88 (46) 07.05.90. Бюл. Р 17 (71) Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов А1Я СССР (72) В.В. Варгин, Т,А.Иванникова и Б.Ф. Семенов (53) 615.2 (088.8) (56) Peiris I.S.M., Porterfield I.S.

Antilogy mediated enhancement. Nature, 1979, v. 282, р. 509. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К

ВИРУСУ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА В АСЦИТ:НОИ ЖИДКОСТИ (57) Изобретение относится к медицинской вирусологии, а именно к иммунологическому определению антител к вирусу клещевого энцефалита (КЭ)и Цель изобретения — увеличение чувствительности определения субнейтрализующих количеств антител к вирусу КЭ в тесте антителозависимого усиления реплика-. ции вируса КЭ. Способ заключается в дополнительной инкубации инфекционных комплексов с антисывороткой. IIocИзобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к определению антител к вирусу клещевого энцефалита.

Цель изобретения — увеличение чувствительности способа, Способ выполняется следующим образом.

Готовят десятикратные разведения вируса клещевого энцефалита (КЭ) и исследуемых образцов на среде RPMI„„SU„, 3M2857 ..А1

2 ле первого этапа реакции в течение 3090 мин в смесь вирус-антитела добавляют антисыворотку против иммуноглобулинов исследуемого образца в дозе

2-8 преципитирующих в реакции диффузионной преципитации в агаре единиц.

Определяемые антитела реагируют с вирусом КЭ, а сформированные инфекционные комплексы, несущие иммуноглобулины,с соответствующими .антииммуноглобулинами. Сформированные инфекци.онные комплексы вирус-антитела— иммуноглобулины посредством Fc-фрагментов антител из исследуемого образ- ца антииммуноглобулинов взаимодействуют с Fc-рецепторами клеток макрофагаль ного ряда U-937. Наличие и титр антител учитывают с помощью непрямого иммунофлуоресцентного теста по увеличеиии числа клеток, ссдерхаких спеиифи- С ческий вирусный антиген. Способ позволяет повысить чувстительность по сравнению с прототипом в 100 раз и регист- р

t рировать положительную реакцию при . ед разведении иммунного к вирусу КЭ об- р разца 1: 10

1640 с добавлением 0,03+0,005 мг/мп глютамина. В лунках стерильной планшеты для иммунологических реакций в объеме по 50 мкл смешивают суспензию вируса в дозе 1 0+5 БОЕ (бляшкообразующих единиц ) 0,1 мл с исследуемым

7 образцом в разведении 1:10 ро 1:10

Смесь инкубируют при 37 С в течение

60 10 мин в атмосфере 3+0,57 С0 .

Затем к смеси вирус-антитела добавляют по 50+2 мкл антисыворотки к имму-

1562857 4 ноглобулинам исследуемого образца в дозе 2-8 преципитирующих в РДПА (реакции диффузной пре 1ипитации в агаре единиц. Смесь инкубируют дополнитель- но в течение 60+1 О.мин при 37+1 Ñ в атмосфере 3+0,5% СО, После повтор ного инкубирования в каждую лунку планшеты к смеси вирус-исследуемый образец-антииммуноглобулиновая сыворот- Ip ка добавляют по 50+2 мкл суспензии клеток U-937 в дозе 80015 тыс/мл, приготовленной по среде RPMI-1640 с добавлением 0,03 0,005 глютамина и 10+2 эмбриональной телячьей сыво- 15 ротки. В контролях используют смеси: вируса с сывороткой, содержащей (по данным дргуих серологических тестов ) антитела к вирусу КЭ, вируса с нормальной сывороткой гомологичной по иммуноглобулинам обследуемому образцу, вируса с антисывороткой к иммуноглобулинам, отличным от используемых в опыте с исслецуемь|м образцом.

Спустя 9614 ч после инкубирования 25 планшеты при 37+1 С в атмосфере с

31-0,5% СО из лунок отсасывают 0,15.1 0,002 мл надосадочной жидкости, до-., бавляют 0,15+0,002 мл физиологического раствора, содержимое лунок перемешивают интенсивным пипетированием и переносят на поверхность предметного стекла 20+0,005 мкл суспензии клеток ° Каплю подсушивают на открытом воздухе при комнатной температуре.

Подсушенный материал на поверхности стекла фиксируют в охлажденном до

-2032 Ñ ацетоне в течение 20ф2 мин.

Результаты способа учитывают с помощью непрямого иммунофлуоресцентного мето- 40 да, где используют антитела к вирусу

КЭ и меченные флуоресцеином антитела к соответствующим иммуноглобулинам.

В-исследуемых каплях суспензий клеток U-937 подсчитывают количество кле45 ток со специфической флуоресценцией из расчета на 500 об "ледованных клеток, Результат считают положительным при увеличении доли содержащих ан". тиген вируса КЭ клеток в сравнении с контролем (вирус + нормальная сыворотка + антииммуноглобулин при Р 0,05.

Предлагаемый способ позволяет повьгсить чувствительность по сравнению с звестньтм в 100 раз, так как при добавлении антииммуноглобулинов эффект усиления репликациивируса клещевого энцефалита в клетках U-937 регистрируют при больших разведениях исследуемого образца.

Способ позволяет регистрировать положительную реакцию при разведении исследуемой иммунной к вирусу КЭ асцитной жидкости мьппей 1:10-, Пример 1. Готовят десятикратные разведения вируса КЭ и исследуемой иммунной асцитной жидкости на среде PPMI-1640 с добавлением 0,03 мг/мл глютамина. Смешивают в лунках стерильной планшеты для иммунологических реакций в объеме по 50 мкл суспензии вируса в дозе 10 БОЕ/О,1 мл с исследуемым образцом в дозе от 1:10 до 1:107

Смесь инкубируют при 37 С в тео чение 60 мин в атмосфере З . СО, Затем к смеси вирус-антитела добавля" ют по 50+2 мкл антисыворотки к иммуноглобулинам исследуемого образца в дозе 4 преципитирующих в РДПА иммуноглобулины единиц. Смесь инкубируют дополнительно в течение 60 мин при

37 С в атмосфере 3% СО . После повторного инкубирования в каждую лунку планшеты к смеси вирус-исследуемый образец-антииммуноглобулиновая сыворотка добавляют по 50 мкл суспензии клеток Б.-937 в дозе 800 тыс/мп, приготовленной на среде ВР>П-1640 с добавлением 0,03 Mr/мл глютамина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки. В контролях используют смеси вируса с сывороткой мьш ей иммунной по данным иммуноферментного метода к вирусу К3, вируса с нормальной сывороткой, гомологичной по иммуноглобулинам исследуемому образцу (мышиная сыворотка); вируса с антисывороткой к иммуноглобулинам кролика, Спустя 96 ч после инкубирования планшеты при 37 С в атмосфере с З .

СО из лунок отсасывают 0,15 мл недосадочной жидкости, добавляют 0,15 мл физиологического раствора, содержимое лунок перемешивают интенсивным пипетированием и переносят на поверхность предметного стекла 20 мкл суспензии клеток. Каплю подсушивают на открытом воздухе при комнатной температуре. Подсушенный материал. фиксируют в охлажденном до -20 С ацетоне в о течение 20 мин. Результаты способа учитывают с помощью иммунофлюоресцентного метода, где используют. антитела кролика к вирусу К3 и меченные флуоресПример 2. Определение антител к вирусу КЭ в асцитной жидкости мьппей при инкубировании в течение

30 мин, !

Составитель P Гуменюк

Редактор Л. Гратилло Техред М.Дидык Корректор С. Шекмар

Заказ 1062 Тираж 507 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж»35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

5 1562857 цеином антитела к имчуноглобулнйам Формула изобретения

1 кролика. Способ определения антител к вирусу клещевого энцефалита в асцитной жидкости путем инкубнрования вируса с исследуемым образцом, добавления клеток макрофагально-моноцитарного ряда, культивирования и оценки титра антител по увеличению числа клеГотовят десятикратные разведения 10 ток, инфицированных вирусом, о т— суспензии вируса КЭ и исследуемой л и ч а ю шийся тем, что, с иммунной жидкости мышей как в приме- целью увеличения чувствительности ре 1. Инкубируют смесь вирус-асцит- способа, инкубирование проводят дважная жидкость на первом этапе и смеси ды по 30-90 мин, причем при повтор вирус-асцитная жидкость-антииммуно-, 15 ном инкубировании; добавляют анти глобулина на втором этапе при 37 С сыворотку к иммуноглобулинам против о в течение 30 мин. Дальнейшую обработ- вируса клещевого энцефалита в дозе ку проводят как в примере 1. 2-8 преципитирующих единиц.