Способ определения активности антитромбина iii

 

Изобретение относится к медицине и касается определения активности основного ингибитора системы свертывания крови, антитромбина III. Целью изобретения является повышение точности способа определения активности антитромбина III. Цель достигается тем, что определение активности антитромбина III в капиллярной крови осуществляют способом-прототипом, с последующим определением показателя гематокрита плазмы (Y). Конкретное значение активности антитромбина III капиллярной крови без учета разведения плазмы и гематокрита плазмы (Y) используют для расчета окончательной активности антитромбина III капиллярной крови по формуле 0,1X <SP POS="POST">.</SP> (7 + Y)/Y, где X - значение активности антитромбина III без учета объемной доли плазмы

Y - объемная доля плазмы

7 - коэффициент разведения. Изобретение позволяет определять активность антитромбина III в капиллярной крови и существенно повысить точность способа. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК цц g С 01 N 33/86

ВЕОЮ

ЯЩИК TI

Б.-15118

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

Г1О ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4215,62/28-14 (22) 23.03.87 (46) 07.05,90. Бюл. Ф 17 (71) Белорусский институт усовершенствования врачей и Минский государственный медицинский институт (72) Е.П. Иванов, И.П. Данилов и Л.А. Бизюк (53) 6! 2.015 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N- 1269024, кл. С 01 N 33/86, 1986. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

АНТИТРОМБИНА (III) (57) Изобретение относится к медицине и касается определения активности основного ингибитора системы свертывания крови, антитромбина III Целью изобретения является повышение точности способа определения активности антитромбина III. Цель достигается

Изобретение относится к области медицины и касается определения активности основного ингибитора системы свертывания крови, антитромбина III.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Для осуществления способа необходимы следующие реагенты.

Тромбин 20 ед NIH/ìë в 0,15 ИаС1.

Заготовленный раствор тромбина активностью 100 ед NIH/ìë хранят в силиконированных флаконах при температуре — 20 С, перед употреблением разводят 0,15 M NaC1 до требуемой активности

„„SILJ„„3 562859 тем, что определение активности антитромбина III в капиллярной крови (х) осуществляют способом-прототипом, с последующим определением показателя гематокрита плазмы (у). Конкретное значение активности антитромбина

III капиллярной крови беэ учета разведения плазмы и гематокрита плазмы (у) используют для расчета окончательной активности антитромбина ТТТ капиллярной крови по формуле О,Ix (7 + « ) где х — значение активносУ ти антитромбина III беэ учета объемной доли плазмы; у — объемная доля плазмы 7 — коэффициент разделения. д

Ф

Изобретение позволяет определять активность антитромбина III в капиллярной крови и существенно повысить точность способа. I табл.

Фи@

Фиброноген 10 г/л в 0,15 М NaC1

С73 (достаточно 5 мл) готовят перед исследованием.

О,!5 M раствор ИаС1 для разведения реагентов.

Контрольная бестромбоцитарная плаэ- плазма — это замороженный пул плазмы от 10 доноров. Хранят его во флао конах по 1 мл, при температуре -20 С в течение 1 года (без снижения активности. антитромбина ХТТ). Перед употреблением плазму размораживают и разводят 0,15 М NaC1 в 10 раз, получая

I0X-ную контрольную плазму.

Стабилизатор (0,15 M NaC1 содержащий тринатрийцитрат в конечной конk центрации 0,05 М).!

562859

Способ осуществляется следующим образом.

Путем прокола койьем мякоти пальца пациента набирают в микропипетку

0,1 мп капиллярной крови и вносят в силиконированную пробирку с 0,7 мл стабилизатора, перемешивают и цент" рифугируют при 300 g в течение 5 мин.

Берут также кровь дпя получения эна10 чения гематокрита плазмы (у) по обычной методике, После центрифугирования.из пробы берут 0,5 мл опытной плазмы неизвестного разведения и определяют в ней активность антитром- 15 бина III по известному способу, В силиконированные пробирки с

0,5 мл I OX исследуемой контрольной и опытной неизвестной концентрации плазм добавляют 0,5 мл раствора тром- 20 бина. Смесь инкубируют на водяной о бане при 37 С и на первой минуте инкубации:встряхивают несколько раз дпя образования малообъемного сгуст.ка фибрина, который можно удалить.

На 4,6,8,11 и 14 мин инкубации 1:„„„ смеси 0,1 мп образовавшейся сыворотки берут пипеткой и добавляют в пробирки с 0,1 мл раствора фибриногена.

По секундомеру регистрируют время свертывания t фибриногена остаточным тромбином сыворотки (забор сыворотки может быть и при других значениях но не более 18 мин). инк

Расчет активности антитромбина

III производят по калибровочной кривой по известной методике.

Для построения кривых скорости инактивации тромбина антитромбином

III контрольного и опытного образцов плазмы на миллиметровой бумаге из полученных в секундах значений извлекают десятичный логарифм

lgt . Кривые скорости инактивации тромбина антитромбином строят для контрольного и опытного образцов плазмы в координатах Lgt c (на оси ординат), t „„„ (на оси абсцисс).

Для вычисления активности антитромбина III в опытном образце вна- 50 чале совмещают начальные точки кривых (если они не совпадают ) с соблюдением угла их наклона, чем вносят поправку на различное содержание антитромбина Т в образцах плазмы и коррегируют ошибку отмеривания образцов, Любую точку на кривой скорости .инактивации тромбина антитромбином

ТТТ контрольного образца плазмы принимают за 100Е активности антитромбина ТТТ. Такая точка взята на .10 мин инкубации смеси. К ней соотносят точку(„я„ 10 мин) на кривой для опытного образца плазмы капиллярной крови и получают промежуточное значение активности антитромбина III капиллярной крови-(х). Окончательное значение активности антитромбина III капиллярной крови рассчитывают,учиты-, вая полученное ранее значение гематокрита плазмы (у) по формуле: активность антитромбина III капиллярной

7 + крови =0,1х (- †--).

У

Пределы нормальных колебаний активности антитромбина III капиллярной крови, определен. ые для донорской группы (20 чел.) составляют 941467 (x + 26); 120+2,9% (х+$ ).

Пример 1. У пациента 1 исследовали капиллярную кровь предлагаемым способом в динамике (й н, 4 6, 8,11 и 14 мин) и получили значения — 43, 60, 81, 129, 205 с и значения 1gt = 1,633; 1,778; 1,908; 2,111 и 2,312 соответственно„ Для построения калибровочной кривой исследовали контрольную 107.-ную плазму при тех же значениях t д„, получили t с =

= 37, 49, бб, 102 и 157 с и соответственные значения 1gt с = 1,568, 1,690, 1,820, 2,009, 2,196.

По полученным значениям 1gt строят кривые для контрольного образца плазмы (k) и для исследуемого образ ца пациента 1 (П,). После совмещения начальных точек кривых опытного и контрольного образцов и соотношения точек кривых, взятых на 10 мин инкубации, найдено, что промежуточное значение активности антитромбина III (х) равно 1 063 . Значение гематокрита плазмы (y) пациента 1 равно 0,5, Окончательное значение активности антитромбина ТТТ капиллярной крови с учетом разведения плазмы опытного образца получают при использовании формулы: активность антитромбина III капиллярной крови у пациента 1 равно

+ у

0,1х (— -- ) = 1597. что выше нормы.

Пример 2. При исследовании проб капиллярной крови у пациентов 2 и 3 в динамике (t „„= 4,6,8,11 и 14 мин) получены одинаковые значения

tc = 31,38,46,63,86 с и соответствен5 15628 но им значения 1 = 1,491; 1,580;

1,663, 1,799 и 1,934, Однако гематокрит плазмы у пациента 2 равен

0,5, у пациента 3 — 0,57. Внося поправку на различную концентрацию ис5 следуемой плазмы капиллярной крови пациентов 2 и 3 путем подстановки зназначений гематокрита плазмы в формулу, получаем: активность антитромбина III капиллярной крови пациента 2

7 + 0 5 равна 0 l i 70 (- — — -) = 105K что

О 5

1 укладывается в пределы нормьц у пацен7 + О 57 та 3 равна 0 01 70 (- — — --) = 937. 15

Э

0,57 что ниже нормы.

По известному способу определение активности антитромбипа III(AT-III) осуществляют в плазме крови без уче- 20 та гемоконцентрационных сдвигов. В сосудистом русле кровь осуществляет свои функции, в частности гемостатические, действуя всем своим объемом.

Антитромбин III содержится в плазме 25 крови, объемная доля которой различная в разных образцах крови. Не бу59 6 заявляемый способ точнее в сравнении с известным.

Формула изобретения

Способ определения активности антитромбина ЕЕЕ путем стабилизации и разведения крови, центрифугирования, добавления тромбина с активностью 20 ед/чл с последующим определением активности антитромбина

III в динамике, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа, исследование проводят в плазме капиллярной крови, дополнительно определяют объемную долю плазмы, рассчитывают активность антитромбина III без учета объемной доли плазмы по формуле

АТ III (3) = О, lх (-- — ) >

7 + у где AT III — активность антитромбина

ЕЕЕ, 0,1 - объем капиллярной крови; х — значения активности AT III без учета объемной доли плазмы; у — объемная доля плазмы;

7 — коэффициент разведения. дет поэтому полного соответствия между выявляемой активностью антитромбина III в плазме крови и его истин- 30 ной активностью в единице объема крови без учета объемной доли плазмы крови.

С целью повышения точности заявляемого способа исследование проводят в плазме капиллярной крови, дополнительно определяют объемную долю плазмы, активность антитромбина ЕЕЕ без учета объемной доли плазмы и рассчитывают в процентах активность анти-40 тромбина III по формуле AT-III

7 + у

=О, l х (— — -), где х — значение аку тивности антитромбина III без учета объемной доли плазмы, у — объемная 45 доля плазмы крови.

В таблице приведены конкретные данные определения активности антитромбина III в группе (2! человек) практически здоровых доноров. Функ- 50 циональная активность антитромбина

III определялась в плазме крови по известному способу без учета объемной доли плазмы и в тех же образцах по. предлагаемому способу. 55

Учитывая выявленные ошибки определения активности антитромбина III в пробах по известному способу (таблица), найдено, что в среднем на 7,35Х

III,X, Ошибка

Активность ATпо способу

Проба по из вестному способу, 7.

Предла ..аемому

Изв ест ному

Примечание. Плюс (+) — результат завышенн; минус (-) — результат занижен.

1 112,05

2 130,95

3 101,25

4 97,2

5 106,65

6 125,55

7 I!3,4

8 182,25

9 109,35

1О 116,1

11 105,3

12 110,7

13 126,9

14 97,2

15 1!3,4

16 95,85

17 122,85 !

8 122,85

19 122,85

20 103, 95

21 124,2

122,22

145,5

106,56

102,29

123,11

132,13

126,0

176,43

113,1

124,37

112,8

127,78

129,04

98,84

100,27

89,93

124,92

1!7,7

127,06

99,06

122,18

-! 0,17 — 14,5

-5,31

-5,09

-16,46

-6, 58 — 12,6

+5,82

-3,75

-8,27

-7,5

-17,08

-2,14

-1, 64

+13,13

+5,92

-2,07

+5,15

-4, 21

+4,89

-2, 02