Штамм культивируемых гибридных клеток животных мus мusсulus х мusтеlа vison - продуцент многоканальных иммуноглобулинов класса j @ g норки

 

Изобретение относится к биотехнологии, а точнее к получению клеток-продуцентов различных белков. Целью изобретения является получение штамма межвидовых гибридом мышь-норка, обладающего более высокой продукцией и синтезирующего более стабильный при хранении JGG норки. Методом соматической гибридизации клеток мышиной миеломы N50 со спленоцитами норки, иммунизированной суммарным иммуноглобулином норки, получены соответствующие гибридомы. Методом клонирования получена стабильная культура гибридных клеток мышь-норка, синтезирующая иммуноглобулин класса JGG в количестве 500-1500 нг/мл. Указанная культура лепонирована в коллекции Института цитологии, где ей присвоен номер ВСКК (п) N231Д. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51) 4 С 12 N 5/00, 5/02

-.",,(Р3 !3 У

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ . flQ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К д BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4290683/31-13 (22) 27.07.87 (46 ) 15. 11.89. Бюл. № 42 (71 ) Институт цитологии и генетики

СО АН СССР (72) Н.Л.Галахарь, С.Н.Дьяченко, Е.Г.Уфимцева, А.В.Таранин и

О.К.Баранов (53) 616. 98: 51 .8 (088 .8) (56) Галахарь Н.Л. и др. Особенности получения межвидовых гибридом мьппьнорка — Материалы Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток в культуре. M.: 1986, с.97-98. (54) flITAMM KYJIbTHBHPYEMbE ГИБРИДНЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUSxMUSTEIA.

VIS0N — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ

ИММУНОГЛОБУЛИНОВ КЛАССА I g G НОРКИ (57) Изобретение относится к биотехИзобретение относится к биотехнологиии, а именно к получению клетокнродуцентов различных белков.

Цель изобретения — получение штамма межвидовых гибридом мышь-норка, обладающего более высокой продукцией и синтезирующего более стабильный при хранении Ig норки.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции клеточных культур под № 231.

Пример 1. Морфология клеточной культуры.

Культура гибридных клеток представляет собой округлые, слабо прикрепляющиеся к субстрату, несколько варьирующие по величине, с ядрами, ÄÄSUÄÄ 1521772 А 1

2 нологии, а точнее к получению клетокпродуцентов различных белков. Целью изобретения является получение штамма межвидовых гибридом мышь-норка, обладающего более высокой продукцией и синтезирующего более стабильный при хранении IgG норки. Методом соматической гибридизации клеток мышиной миеломы ¹ 50 со спленоцитами норки, иммунизированной суммарным иммуноглобулином норки, получены соответствующие гибридомы. Методом клонирования получена стабильная культура ги бридных клеток мышь-норка, синтезирующая иммуноглобулин класса Ig G в количестве 500-1500 нг/мл. Указанная культура депонирована в коллекции Института цитологии, где ей присвоен номер ВСКК (П) № 23 1Д.

2 табл.

Сп занимающими большую часть клетки.

ЬЭ

Ма4

Цитоплазма в виде тонкого ободка.

Иногда ядро смещено °

Кариология штамма. Модальный класс хромосом штамма 82-85. Среды хромосом клеток как телоцентрические (мышиные), так и метацентрические (норочьи) .

Культуральная характеристика.

Среда культивирования: среда ДЕМЕ В или RPMI-1640 с 10Х эмбриональной ай коровьей сыворотки, 2 m M глютамина

80 мкг/мл гентамицина.

Характер роста клеток: стационарная суспензия. Частота пересевов: через 3-4 сут. Посевная доза клеток:

152 1 772

Культуру клеток мышинон. миеломы

NS0 используемую для гибридизации, дефицитных по гипоксантингуанин-фосфориеозилтрансфераэе (ГГФРТ3, культивируют на среде ДМЕМ с добавлением

10% сыворотки крупного рогатого скота, глютамина, 8-азагуанина и антибиотиков.

1 .10"кл/мл. Кратность рассева: 1: 2

1:3.

Консервация клеток: клетки заморожены на 8, 16, 30 пассажах. Общее количество ампул: 15 по 5.10 клеток в ампуле.

Криозащитная среда: ростовая среда с 50% эмбриональной коровьей сыворотки и 10% глицерина. Выживаемость 10 при размораживании 65-68%.

Сведения о контаминации клеток штамма.

Бактерии, грибы, дрожжи, микоплазмы не обнаружены. Обнаружены С-частицы.

Физиолого-биохимическая характеристика.

Клетки растут при +36,5-37 С и оптимуме рН от 6,0 до 7,1. При культивировании клетки штамма секретируют в культуральную среду Х@ норки.

Образцы культуральной жидкости штамма 4-34-А4 исследуют иммуноферментным методом иа нитроцеллюлозе. 25

В качестве индикатора используют диаминобензидин. Каждый иммуноферментный анализ сопровождают калибровкой норочьего Ig и контролем— калибровкой мышиного Ig. Уровень про- 0 дукции Ig норки соответствует 1000500 нг/мл. о

При хранении при +4 С в течение

8 сут содержание Ig норки в образцах культуральной среды остается стабильным (не снижается), Пример 2. Штамм 4-34-А4 представляет собой соматический межвидовой гибрид клеток реципиентов и клеток-доноров.

В качестве клеток-реципиентов используют двухсуточную культуру клеток миеломы мыши NSO в количест1 ве 10 . В качестве клеток-доноров используют спленоциты норки, пред45 варительно иммунизированной суммарным Ig норки. В гибридизацию брали

В-лимфоциты (10 ) селезенки норки.на третий день после последней инъекции антигена (Ig норки).

Гибридизацию В-лимфоцитов норки и клеток миеломы мыши ИБО лри соотношении 10:1 соответственно проводят в стандартной среде ДЕМЕ без сыворотки, с добавлением полиэтиленгликоля (М.в. 1500) . После обработки в течение 3 мин полиэтиленгликолем клетки осаждают центрифугированием при

800 об/мин и суспендируют в среде

ДЕМЕ с добавлением 15% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 2 мМ глютамина, 19 мМ пирувате натрия, 4 10 аминолтерина, 10 гипоксантина, 16 10 M тимидина и антибиотиков. Суспензию (10 клеток в

6 мл среды) разливают по 0,1 мл в 96луночные пластиковые плато и культивируют при +37 С в атмосфере 6%-ного

СО . Первую смену среды производят через 5 дней после гибридизации, в дальнейшем — 2 раза в неделю. Через две недели гибридные клетки переводят на среду аминоптерина, а в последующем (еще через неделю) на среду и без гипоксантина и тимидина.

Панели с гибридными клетками регулярно микроскопируют. Культуральную жидкость из тех лунок панели, в которых площади растущих колоний гибридных клеток составляют около

1/3 и более от всей площади лунки, исследуют иммуноферментным методом по схеме сэндвич на синтез Ig корки.

Отбирают колонии с большим уровнем синтеза норки.

При постоянном контроле уровня и специфичности синтеза норки проводят клонирование методом лимитирующих разведений. Первое клонирование проводят иэ расчета 50 клеток на лунку, второе - 10 клеток на лунку, третье — 0,5 клеток на лунку.

При клонировании используют слой клеток-кормилок на спленоцитов мышей линии ВА .Вс nu/пи. Отобранные после третьего клонирования клоны гибридом также исследуют на продукцию

Ig норки. При культивировании клонов

in vitro их периодически, под контролем синтеза реклонируют методом лимитирующих разведений.

По данным о количестве продуцируемого норки, его стабильности, по культуральной характеристике отбирают клон. Клетки клона характеризовались хорошими ростовыми качествами . Клетки клона синтезировали Ig норки в ко5 1521772, личестве 1500-2000 нг/мл культуральной среды.

Клетки клона размножают и при даль- Образцы нейших пассажах получают штамм 4 -34- . культу 5

А4. Его характеристика приведена в ральнои табл. 1 и 2. среды

Результаты исследований образцов культуральной среды клеток штамма

4-34-А4 на разных пассажах приведены в табл.1.

Та блица 1

Продолжение табл. 2

Исходное через сут (Г

4 500

5 800 800

6 1000 1000

7 1000 1000

8 500 500

9 800 800

10 1000 1000

SOO

1000

100Î

1000

Пассаж Образцы Количеклеток культу- ство 18, (штамм) ральной нг/мл среды

Контроль на содержание Штамм

Ig мыши 84-Л2

Следы

1 100

2 80

3 50

4 80

5 50

2 (4-34-А4 ) Из данных табл.2 видно, что Ig продуцируемьй в культуральную среду клетками штамма 4-34-А4 при хранении, оставался стабильным в течение срока наблюдения — 8 дней. В образцах культуральной среды штамма-прототипа

Ig через 3 сут хранения, как правило, не обнаруживается.

По сравнению с известным (прототипным) штаммом гибридных клеток

84-Л2, *синтезируюзим Ig норки в количестве 50-100 нг/мл, предлагаемый штамм гибридом 4-34-А4 синтезирует Ig норки в 10 раз больше (5001000 мг/мл) (табл.1) . Ig норки, синтезируемый клетками штамма 84-Л2 при хранении в холодильнике (+4 С) через

2-3 сут не обнаруживается в образцах культуральной среды.

Уровень Ig в образцах культуральной среды клеток штамма 4-34-А4 при хранении в тех же условиях в течение 8 дней не снижается, т.е. наблюдается большая стабильность продукта (табл. 2) .

Полученный положительный эффект изобретения достигается за счет свойств сконструированной гибридной клетки.

10 (4-34-А4) 25

30 (4-34-А4) 30

3 О (4-34-А4)

3 (84-Л2) 35

30 (84-Д2) 40

Образцы культуральной среды сходное через сут

3 (5 (8

Формула из о бр е те ния

Штамм культивируемых гибридных клеток животных Nus musculus Мызtela vison ВСКК(П) 9 23 1 Д,лродуцент моноклональных иммуноглобулинов класса Ig G норки.

I 2500

П 2000

Ш 2500

1У 2500

I 1000

П 1000

Ш 1500

1У 1500

I 500

П 1000

Ш 500

IV 1000

I 100

П 80

Ш 50

1У 50

I 50

П 50

Ш 80

1У 50

Исследуют стабильность продуцируемого клетками штамма Ig норки при о хранении в холодильнике (4 С) .

Результаты представлены в табл.2 ° 9.

Та блица 2

Количество Ig норки в образцах культуральной среды при хранении

Количество Тя .норки нг/мп

Штамм

4-34-А4 1 1000 . 1000 1000 1000

2 800 800 800 800

3 500 500 500 500

Количество Ig норки нг/мл