Способ определения иммунокомпетентных клеток

 

Способ относится к области медицины и заключается в выделении суспензии лейкоцитов крови, постановке реакций розеткообразования и фагоцитоза, фиксации, окраске и приготовлении мазков. Целью изобретения является интенсификация способа при массовом иммунологическом обследовании, увеличение количества исследуемых образцов, уменьшение количества исследуемого материала и повышение точности способа. Цель достигается добавлением 3 - 7% желатина к 10-кратному раствору Хенкса, что избавляет от загрязнения оболочками эритроцитов клеточные препараты на этапе выделения лейкоцитов

проведением окраски клеток непосредственно в суспензии до нанесения мазков

механическим приготовлением мазков-отпечатков одновременно и однотипно путем центрифугирования при 180 - 400G перевернутой многолуночной емкости с пробами на плотно фиксированные к ней бумажную прокладку с отверстиями и прозрачную пленку, используемую в качестве препаратоносителя.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 G 0) N 33/53

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ л

° Ю

° М

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4301 255/30-1 4 (22) 24.08.87 (46) 30.07.90. Бюл. У 28 (71) Ивановский государственный медицинский институт им. A.Ñ.Áóáíîâà (72) К,А. Лебедев, И.Д. Понякина, В.С.Авдеева и А.А.Ваничкин (53) 615 .375(088 .8) (56) Авторское свидетельство СССР

У 1364986, 986, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИИИУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК (57) Способ относится к медицине и заключается в выделении суспенэии лейкоцитов крови, постановке реакций роэеткообразования и фагоцитоэа, фиксации, окраске и приготовлении мазков. Целью изобретения является интенсификация способа при массовом

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к иммунологии.

Цель изобретения — интенсификация способа при массовом иммунологическом обследовании, увеличение количества исследуемых образцов, уменьшение ко. личества исследуемого материала и повышение точности способа — достигается тем, что на этапе восстановления осмотического давления после лиэиса эритроцитов используют 10-кратный раствор

Хенкса, содержащий 3-7Х желатина, операции дофиксации и окраски клеточных препаратов совмещают, осуществляя их вместо равной по времени и технике исполнения операции подготовки осадка клеток к нанесению мазков (в прототипе), но вместо дистиллированной воды

„.SU: .1582130 A I иммунологическом обследовании, увели,чение количества исследуемых образцов, уменьшение количества исследуемого материала и повышение точности способа. Цель достигается добавлением

3-7Х желатина к 10-кратному раствору

Хенкса, что избавляет от загрязнения оболочками эритроцнтов клеточные препараты на этапе выделения лейкоцитов, проведением окраски клеток непосредственно в суспенэии до нанесения мазков, механическим приготовлением мазков-отпечатков одновременно и однотипно путем центрифугирования при

180-400 g перевернутой многолуночной емкости с пробами на плотно фиксированные к ней бумажную прокладку с отверстиями и прозрачную пленку, используемую в качестве препаратоносителя. к осадку приливают раствор краски, содержащий 10-ЗОЖ метилового или этилового спирта, ресуспендируют, а мазки готовят не вручную, а механическим способом одномоментно для всей партии проб: планшет накрывают листом бумаги, служащей в качестве прокладки, с про- CO битыми в ней отверстиями, соответствующими по диаметру лункам планшета, заТем ацетатцеллюлозной пленкой, предварительно покрытой слоем белка, которая используется в данном случае в качестве препаратоносителя, и сверху кладут крышку с поролоновой прокладкой, которую плотно прижимают к планшету ; осадок ресуспендируют, перевернутый вверх дном планшет центрифугируют при 180-400 g 5 мин, 1582130 выдерживают 20-40 мин, после чего по-лученные окрашенные мазки отпечатки

1 просушивают, промывают водой и вновь просушивают.

Способ осуществляют следующим образом.

В лунку планшета для агглютинации (объем каждой лунки 2 спи) вливают

1,8 мл дистиллированной воды. 0,020,05 мл крови забирают из пальца и сразу же смешивают с водой .в лунке.

Через 40 с в лунку приливают 0,2 мл !

10 кратного раствора Хенкса, содер1 жащего 3-7Х желатина, перемешивают.

Центрифугируют при 150-200 g, надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют 0,3 мл среды 1 99, Полу1 чают суспензню лейкоцитов, готовую для постановки реакции. 20

В лунки планшетов для иммунологи-! ческих реакций одноразового исполь5 зования (объем каждой лунки 0,2 см ) заливают на 0,05 мл полученной суспензии лейкоцитов и равный объем 0,025%- 25 ной суспенэии индикаторных частиц— эритроцитов барана или мьппи, нли клеток пекарских дрожжей, убитых нагреванием, цнтрифугируют при 200 g

1 о

5 мин, инкубируют при 4-10 С 30 мин, затем к осадку приливают 0,020,025 мл раствора, содержащего 0,4% глутарового альдегида, 4% формальдегида, остальное — фосфатный буфер, и выдерживают при комнатной температуре 10 мин. Надосадочную жидкость вы,тряхивают, а к осадку приливают

0,05 мл раствора метилового зеленого пиронина или азур-эозина, содержащего дополнительно 10-30 метилового 40 или этилового спирта, Затем планшет накрывают пропитанной водой бумажной прокладкой с выбитыми в ней отверстиями, соответствуницими лункам планшета, сверху накладывают лист проз- 45 рачной пленки соответствующего планшету размера стороной, предварительно покрытой слоем белка, фиксированного метанолом, затем накрывают крьппкой планшета, к которой снизу приклеен поролон. Крышку плотно прижимают к планшету при помощи резинок или зажимов, после чего осадок клеток тщательно ресуспендируют в краске. Далее планшет переворачивают так, чтобы дно лунок находилось вверху, центрифугируют при 1 80-400 g 5 мин и выдерживают в течение 20-40 мин. Затей пленку вместе с бумагой, снимают с планшета, краске дают стечь и высушивают. Пленку с полученными мазками. отделяют от бумаги, промывают водой и высушивают вновь. Полученные мазки заливают канадским бальзамом, покрывают листом аналогичной пленки и получают препараты, готовые к просчету. Предложенный способ позволяет получить на пленке одновременно 96 мазков (по количеству лунок в планшете).

Пленки к работе готовит следующим образом.

Берут лист гибкой прозрачной пленки, например ацетатцеллюлозной пленки, используемой в качестве основы при производстве рентгеновских или фотографических пластин, разрезают прямоугольники размером 9х12 см, при необходимости (если готовят из отработаиных рентгеновских или фотографических пластин) моют и высушивают.

Затем при помощи ватного или марлевого тампона наносят слой белка (сыворотки крови, раствора альбумина, яич ного белка или желатина), высушивают и фиксируют, выдерживая в метиловом спирте в течение 10 мин.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Иэ пальца у детей в возрасте от 1 до 3 лет забирали по

0,02 мл крови. Кровь немедленно помещали в лунку планшета для агглютинации, содержащую 1,8 мл дистиллированной воды, перемешивали, выдерживали 40 с. Затем приливали 0,2 мл

10-кратного раствора Хенкса, содержащего З желатина, перемешивали.

После забора крови указанным способом у 96 детей планшеты плотно закрывали крьппками и транспортировали в лабораторию (всего 4 планшета по 24 лунки в каждом). В лаборатории планшеты центрифугировали при 180 g в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливали, а к осадку приливали 0,3 мл среды 199. Осадок ресуспендировали,, получали суспенэию лейкоцитов. В лунки трех чистых иммунологических

96-луночных планшетов (объем каждой лунки 0,2 мл) заливали по 0,05 мл полученной суспензии лейкоцитов. По- . сле этого в один планшет приливали по 0,05 мл 0,25 -ной суспензии эритроцитов барана, в другой — по 0,05 мп

0,025 -ной суспензии эритроцитов мьппи, в третий — по 0,05 мл 0,025%ной суспензии клеток пекарских дрож5 158 жей, убитых нагреванием, Центрифугировали при 200 g 5 м«п, инкубировалг прн 6 С 30 мин. 3 ." :нки четь,:рто-о

r..«.:ìeòà {предварительно обработап— ные 0,05 мл водного раствора 0,0l М теофиллина и высушенные) приливали по 0,05 мл полученной от каждого больного суспензии лейкоцитов, планшет инкубировали при 37 С в течение

60 мин, после чего в лунки приливали по 0,05 мл эритроцитов барана (0,025 ной суспензии), центрифугировали при

200 g 5 мин и инкубировали при 6 С

30 мин. По окончании инкубации в холодильнике в лунки планшета заливали по 0,025 мл раствора, закрепляющего розетки (0,4 глутарового альдегида, 4% формальдегида, остальное — фосфат ный буфер). Выдерживали 10 мин. Надосадочную жидкость вытряхивали, а к осадку приливали по 0,05 мл раствора метилового зеленого и пиронина в ацетатном буфере, в который введено

10 этилового спирта. После этого каждый планшет накрывали бумажной прокладкой размером 9»12 см, пропитанной.водой, с выбитыми в ней отверстиями диаметром 5 мм, совпадающими с лунками планшета, сверху наклады— вали лист прозрачной пленки, предварительно покрытой слоем белка, размером 9»12 см (в качестве белка использовали сыворотку крови, раствор альбумина или белок яйца, пленку высушивали, фиксировали в метаноле в течение 10 мин), далее прокладывали слой поролона, крышку планшета и плотно перетягивали полученный комплект резиновыми обхватами. Затем содержимое лунок тща TeJ;bHo ресуспендировали постукиванием планшета. Далее планшеты переворачивали так, чтобы дно лунок находилось вверху, центрифугировали при 180 g в течение 5 мин и выдерживали в перевернутом состоянии

20 мин. После этого крышку снимали, краске давали стечь, а пленку вместе с бумажной прокладкой высушивали. Бумагу снимали, а пленку с мазками про-. мывали водой и вновь высушивали. Высушенные мазки заливали канадским бальзамом и накрывали листом аналогичной чистой пленки. Таким образом на плен— ке размером 9х12 см получали 96 одно— временно приготовленных препаратов, . расположение и величина которых соответствовали расположению и диаметру лунок планшета. Все 384 полученных

2130 6 препарата имели хорошее качество, большинство из них не было загрязнено оболочками эритроцитов, лишь

49 препаратов (12,8 ) имели неболь5

tL e количество оболочек, нисколько не мешающих просчету. Плотность рас-. пределения клеток во всех мазках была одинаковой — нормальной, конгло-, мератов практически не наблюдалось.

Поэтому максимальные различия показателей, просчитанных в трех случай; но выбранных полях препаратов, сос- . тавляли не более 1-2%, что свидетель-!

5 ствует о стабильно высокой точности способа. Общее время приготовления .всех 384 йрепаратов (центрифугирование 5 мин, выдерживание после центрифугирования 20 мин, высушивание до и после промывания мазков 20 мин) составило 45,мин, но из них конкретные затраты труда составляют 10 мин, если вычесть операции, которые не требуют непрерывной работы лаборанта (для сравнения — на приготовление такого же количества препаратов по базовому способу уходит 150 мин непрерывного труда лаборанта).

Пример 2. У рабочих пред30 приятия из пальца забирали 0,03 мл . крови. Кровь немедленно помещали в лунку планшета для агглютинации, содержащую 1,8 мл дистиллированной воды, выдерживали 40 с. Затем приливали 0,2 мл 10-кратного раствора Хенкса, содержащего 4% желатина, перемешивали.

После забора крови указанным способом у 96 рабочих планшеты плотно закрывали крьппками и транспортировали в ла4р бораторию. В лаборатории планшеты цептрифугировали прп !50 g в течение . 5 мин. Надосадочную жидкость сливали, а к осадку приливали 0.,3 мл среды

199. Осадок ресуспендировали, полу45. чали суспензию лейкоцитов. С полученными клетками осуществляли комплекс тестов розеткообразования (PO) и фагоцитоза (4 теста: Е-РО, М-РО, Д-фагоцитоза и Е-PO после инкубации клеток

50 с теофиллином, Е,M,Ä-маркеры — соответственно эритроциты барана, мъппи, дрожжевые клетки) вплоть до получения осадка и вытряхивания надосадочной жидкости так же, как в примере

После этого к осадку клеток приливали по 0;05 мл раствора метилового зеленого и пиронина в ацетатном буфере, в которьп добавляли 20 метилового спирта. После этого планшеты на1582130 крывали бумажной прокладкой размером

9 1 2 см, пропитанной водой, с выбитыми в ней отверстиями диаметром 5 мм, соответствующими лункам планшета, сверху накладывали листы прозрачной пленки, покрытой слоем белка (пленку готовили так же, как в примере 1.), далее прикладывали слой поролона и ( крьппку, все это плотно перетягивали резиновыми обхватами. Затем содержимое лунок тщательно ресуспендировали постукиванием планшета, Далее планшеты переворачивали так, чтобы дно лунок находилось вверху, центрифуги- 15 ровали при 250 g в течение 5 мин и выдерживали в перевернутом состоянии

30 мин. После этого крьппку снимали, краске давали стечь, а пленку вместе с бумажной прокладкбй высушивали. Бумагу снимали, а пленку с мазками промывали водой и вновь высушивали. Высушенные мазки заливали.канадским бальзамом и накрывали, листом аналогичной чистой пленки. Таким об- 25 разом, на прямоугольнике. пленки размером 9х12 см получали 96 препаратов.

"Все 384 полученных препаратов имели хорошее качество. Оболочки эритро. цитов наблюдались в 62 препаратах .. 30 (16,1Ж), но количество их было настолько незначительно, что они не ме-. шали просчету. Плотность распределения клеток во всех препаратах была одинаковой — нормальной, конгломера- 35 тов практически .не наблюдалось, Поэтому максимальные различия показателей, просчитанных в трех случайно выбранных полях препаратов, составляли не более,1-2Х, что свидетельствует о стабильно высокой точности способа. Общее время приготовления

384 препаратов составило 55 мин, однако, если вычесть операции, которые не требуют непрерывной работы лаборанта, то на приготовление пре.паратов уходит всего 10 мин непрерывного труда (по базовому способу—

150 мин) . . Пример 3. У рабочих предпри- 50 ятия из пальца забирали по 0,05 мл крови. Кровь немедленно помещали в лунку планшета для агглютинации, содержащую 1,8 мл дистиллированной воды, пер™ ЛИ, выдерживали

40 с, Затем приливали 0,2 мл 10-крат-! ного раствора .Хенкса, содержащего

7 желатина, перемешивали . После забора крови указанным способом у 96 рабочих планшеты плотно закрывали крышками H транспортировали в лабораторию. В лаборатории планшеты центрифугировали при 200 я в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливали, а к осадку приливали 0,3 мл среды 199. Осадок ресуспендировали, получали суспензию лейкоцитов . С полученными клетками ставили комплекс тестов розеткообразования (4 теста:

Е-РО, М-РО, Д-фагоцитов и E-,РО после инкубации клеток с теофиллином) вплоть до получения осадка и вытряхивания надосадочной жидкости так же, как в примере 1. После вытряхивания надосадочной жидкости к осадку приливали по 0,05 мл раствора метилового зеленого пиронина в ацетатном буфере, i который добавляли 307. этилового спирта. После этого планшеты накрывали бумажными прокладками размером 9«12 см, пропитанными водой, с выбитыми в них отверстиями диаметром

5 мм (каждое отверстие должно находиться против лунки), сверху накладывали листы прозрачной пленки, предварительно покрытой Ьтоем белка (пленку готовили так же, как в примере l), далее прикладывали слой поролона и крышки планшетов. Все. это плотно перетягивали резиновыми обхватами. Затем содержимое лунок тщательно ресуспендировали постукиванием планшета. Далее планшеты переворачивали так, чтобы дно лунок находилось сверху, центрифугировали при 300 g в течение 5 мин и выдерживали в перевернутом состоянии 30 мин, После этого крышку снимали, краске давали стечь, а пленку вместе с бумажной прокладкой высушивали. Высушенные. мазки заливали канадским бальзамом и накрывали листом аналогичной чистой пленки. Таким образом на прямоугольнике пленки размером 9 12 см получали 96 препаратов, Все 384 полученных препарата имели хорошее качество. Оболочки эритроцитов наблюдали в 109 препаратах (28,4Ж), что связано, вероятно, с большим количеством забираемой для анализа крови (0,05 мл). Однако количество оболочек в препаратах было настолько незначительным, чтб бни не мешали просчету препаратбв . Плотность распределения клеток во всех препаратах была одинаковой — нормальной, конгломера-. тов практически не наблюдалось.

1582130

1О

Под зобный анализ качественных характepHcTHK мазков (определяющих воспроизводимость и точность метода), а также затрат времени .на их получе5 ние для данных примеров показал следующее.

Предлагаемый способ дает воэможность получать более точные конечные результаты, что выражается: а) в стабильной равномерно одинаковой нормальной густоте всех препаратов, в то время как при изготовлении мазков вручную (прототип) густота препаратов сильно колеблется и зависит, в частности, от индивидуальных особенностей и опыта лаборантов, в связи с чем

10Х препаратов не удается просчитать из-эа плохого качества мазков1 б) в . том, что предлагаемый способ дает воз-,0 можность стабильно получать препараты беэ оболочек эритроцитов или с небольшим количеством оболочек, практически не мешающих просчету препаратов, в то время как при использовании прото- 25 типа более половины всех препаратов были загрязнены оболочками эритроцитов, что в 10Х случаев привело к невозможности просчета препаратов. Таким образом, данные свидетельствуют о большей точности предлагаемого способа в сравнении с прототипом.

Предлагаемый способ позволяет практически полностью устранить конгломераты из пРепаРатов, что также ведет к увеличению точности способа, Действительно, при просчете результатов в трех параллельных пробах различия в полученных данных были по предлагаемому способу достоверно (P (О, 01)40 и существенно (в 2,1-3,3 раза) ниже, чем по прототипу, что непосредственно уже свидетельствует о более высокой точности предлагаемого способа, Осуществление операций предложен- 45 ного способа и подготовка к ним занимают времени в 4,4-5,4 раза меньше, чем в базовом способе (прототипе).

При приготовлении препаратов предложенным способом планшет после центрифугирования выдерживают в течение 2040 мин, не затрачивая труда, в то время как приготовление мазков вручную при базовом способе требует не менее

150 мин непрерывной работы лаборанта.

Если учесть, что предыдущие этапы выполнения способа, включая подготовку реактивов непосредственно перед реакцией, в предложенном и базовом способах практически совпадают и время их выполнения одним сотрудником по дaííûì хронометража около )22 мин, то в целом на .осуществление предложенного способа идет в 2,8-2,6 раза меньше рабочего времени, чем на осуществление базового. Имеет место определенная экономия реактивов (спирта, краски) и препаратоносителя (предметных стекол) при использовании предложенного способа по сравнению с ба3OBBIM е

Таким образом, предложенный способ по отношению к прототипу (базовому способу) является более совершенным и точным за счет существенного улучшения качества приготовляемых препаратов, позволивших получить более стабильные и воспроизводимые результаты, благодаря очистке препаратов от оболочек эритроцитов и равномерного распределения клеток на пленке эа счет перехода с ручного труда на стандарт" ный механический способ одновременного и однотипного приготовления большого количества мазков-отпечатков, Он позволяет получить конечные ре-,. зультаты в 2,8-2,6 раза быстрее, чем при использовании базового способа, что дает воэможность выполнить предложенный способ для 96 образцов крови одним сотрудником, по хронометрическим данным, приблизительно за 44,5 ч рабочего времени.

Точность и краткость выполнения предложенного способа, простота и доступность его для, всех лабораторий выводит комплекс микрометодов розеткообраэования и фагоцитоза на качественно новый уровень — возможности практического применения для массовых обследований населения.

В связи с иэложенйым можно рекомендовать широкое внедрение способа при массовых иммунологических исследованиях населения (не менее 96 человек за 4-5 ч рабочего времени), исиспользование его не только в научных лабораториях, но и во всех практических клинических лабораториях для оценки иммунного статуса человека.

Способ полностью готов к внедрению, прост в исполнении, дешев, нетрудоемок, точен, краток во времени, требует минимального количества дешевых и доступных .реактивов и оборудования.

15821

Составитель П.Бонарцев

Техред JI.Îëaéíûê Корректор И. Самборская

Редактор А. Маковская

Заказ 2086 Тираж 512 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета но изобретениям н открытиям прн ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðoä, ул. Гагарина, 101

Ф о р м у л а и s о б р е т е н.и я

Способ определения иммунокомпетентных клеток, включающий отделение лейкоцитов от гемолизированных эритроцитов, смешение лейкоцитов с индикатор5 ными частицами в лунках планшета, центрифугирование смеси, фиксацию клеток, приготовление мазков клеток, их orðàïaâàíèå с последующим учетом иммунокомпетентных клеток, отличающийся тем, что, с цепью, интенсификации способа при массовом . иммунологическом обследовании, увеличения количества исследуемых о Ваащов.lg

30 уменьшения количества исследуемого материала и повышения точности способа, отделение лейкоцитов от гемолизированных эритроцитов проводят при центрифугировании в соленом растворе в 3-7Х желатина, окрашивают осажденные клетки после фиксации, а мазки клеток приготавливают на по верхности пленки с белковым покрытием в процессе центрифугирования планшета с ресуспендированными в лунках, фиксированными окрашеннымй клетками и их осаждения из лунок на поверхность пленки.