Плазмидная днк pmtf59, предназначенная для транспозонного мутагенеза бактерий семейства еnтеrовастеriасеае

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии. Цель изобретения - конструирование PMTF59 мол. м. 40,8 MG, содержащая транспозоны TN 5 и TN 9 и проявляющая температурную нестабильность в клетках ENTEROBACTERIACEAC при 37°С, которая предлагается для транспортного мутагенеза представителей этого семейства. Плазмида PMTF 59 состоит из плазмиды PM 38, в которую встроены транспозоны TN 5 и TN 9. Плазмида детерминирует устойчивость к стрептомицину, канамицину и хлорамфениколу. SMA I - ECO 1471 - фрагмент плазмиды PMTF 59 ответственен за репликацию и температурную нестабильность плазмиды в бактериях семейства ENTEROBACTERIACEAE. Плазмида PMTF 59 коньюгативна и может передаваться широкому кругу хозяев бактерий.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (И), цц5 С 12 N 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

У, 1

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫ» ИЯМ

ПРИ П.(НТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4445104/30-13 (22) 20,06.88 (46) f5.10.90. Бюл. Р 38 (71) Белорусский государственный университет .им. В.И. Ленина (72). М.А. Титок, Н.П. Максимова, В.A. Прокулевич и НЗ,К. Фомичев (53) 575,224..2;577,2(088.8) (56) Kleckner N., Cell, 1977, р. 1 1-23. . Антибиотики, 1978, т. 23, Р 9, с. 779-784. (54) ПЛАЗМИДНАЯ 7IHK pNTF59 ПЛЯ ТРАНСПОЯОННОГО МУТАГЕНЕВА БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА FNTFR0BACTFRIACFAF, (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к r åíåòè÷åcêoé инженерии. Пель изобретения — конструИзобретение относится к области биотехнологии, а именно генетической инженерии.

1(елью изобретения является конструирование плазмиды рМТР59, содержащей транспоэоны Тп 5, Тп 9 и проявляющей температурную нестабильность в клетках Fntегоbacteriaceae при 37 С, которую можно использовать для транспозонного мутагенеза пред« ставителей этого семейства, Плазмида рМ?159 является генетически модифицированным вариантом ппазмиды рМ38, обнаруженной ранее в клетках штамма Pseudomonas Sp М, и получена путем встраивания в состав плазмиды pN38 транспоэонов

Тп 5 и Тп 9.

2 ирование рМТР59 мол.м. 40,8 Ng, содер1 жащей транспозоны Тп 5 и Тп 9 и проявляющей температурную нестабильность в клетках Fntегоbactегоaceae при 37 С, которая предлагается для транспортного мутагенеза представителей этого семейства. Плазмида рМТР59 состоит из плазмиды рМ38, в которую встроены транспозоны Тп 5 и Тп 9. Плазмида детерминирует устойчивость к стрептомицину, канамицину и хлорамфениколу, Sma I — Fco1471 — фрагмент плазмиды

pNTF59 ответственен эа репликацию и температурнуюнестабильность плазмиди н бактериях семейства Entегоbacteriaceae. Плазмида pMTF59 коньюгативна и может передаваться широкому кругу хозяев бактерий. Плазмида рМТР59 включает детерминанту устойчивости к стрептомицину (Sm ), транспозоны Тп 5 (Km ) и Тп 9 (Cm"), а также область, ответственную эа репликацию и температурную нестабильность при 37 С, которая локализована,в участке J1HK протяженностью 6,9 z,ï,о. и состоит из следующих элементов: Sma I- Uba 44фрагмент (О 9 т,п.о,); Uba 44

Hind III - фрагмент (1,8 т,п,о,);

Hind Ш вЂ” Bpl II — фрагмент (0,2 т.п.о.): Bpl II . — Hind III — фрагмент (1,0 т..п,о.); Hind III — Sma I (0,1 т.п.о.).; .Sma I — Есо 147 — фраг- мент (1,2 т,п.о.);. Fco 147 — Вя1 II фрагмент (0,1 т.п.о.); Bpl II

Fco 147.1 (1,6 т.п.о.) — hpагмент.

1599434

Мол. м. плазмиды 40,8 Мя — размер

61,2 т.п.о.

Плазмида рЫТР59 сообщает клеткам, в которых она находится, устойчивость к трем антибиотикам " стрептомицину, канамицину и хлорамфениколу.

Плазмида рМТР59 конъюгативна и передается широкому кругу хозяев семейства Fntегоbacteriaceae с частотой 10 -4- 10-, а в гомологичные шФаммы с частотой 10 /на клетку д >нора.

Плазмида рМТР59 находится в бактериях штамма Р.cali 0600/pMTF59, который хранится во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика под N -ВКПМ

В 4309.

Плазмида pNTF59 обладает уникальной способностью наследоваться в несЕлективных условиях в клетках любого штамма семейства Fntегоbacteriaceae при 28 С и утрачиваться со

10АХ-ной частотой .при 37 С.

Пример 1. Клетки штамма

Е.coli С600, содержащие плазмиду

pMTF59, выращивают в течение 18 ч в жидкой питательной среде при 28 С, осаждают центрифугированием в течение 15 мин при 15000 р и ресуспендируют в прежнем объеме физиологическОго раствора. Затем из соответствующих разведений делают высевы на плотную питательную среду, содержащую канамицин в концентрации 25 мкг/мл для отбора вариантов с транспозицией

Тй 5. Чашки с питательной средой перед засевом предварительно прогревают при 37 С в течение 20-30 мин. После 40 посева бактерии культивируют при 37 С в течение 24-48 ч и затем выросшие

1 клоны проверяют на устойчивость к остальным плазмидным маркерам, Клоны, наследующие только один маркер, соогветствующий транспозону Тп 5,(Km") появляются с частотой 8,8 -10 (по отношению к исходному количеству клеток перед посевом), а среди них с частотой 1,17, отбирают ауксотрофные мутанты.

Пример 2. Для получения ауксотрофных мутантов используют штамм Frwinia herbicola 103К/pMTF59, Способ получения ауксотрофных мутантов такой же, как и в примере 1 раз- 55 личия состоят в том, что частота транспозиции транспозона Тп 5 в хромосому этого штамма 9,9 10 а ауксотрофные мутанты отбирают с частотой 5,57.

Пример 3. Для получения ауксотрофных мутантов используют штамм фитопатогенных бактерий Erwinia chrysanthemi FNA 49/pMTF59, Способ получения ауксотрофных мутантов такой же, как и в примере 1, различия состоят в том, что частота транс позиции транспозона Тп 5 в хромосо му этого штамма 1,2 10, а ауксотрофные мутанты отбирают с частотой

2,07.

Пример 4, Дпя получения ауксотрофных мутантов используют штамм фитопатогенных бактерий Erwinia species 106-7/рг1ТР59. Способ получения ауксотрофных мутантов такой же, как и в примере 1, различия состоят в том, что частота транспозиции транспозона Тп 5 в хромосому этого штамма 5,! .10, а ауксотрофные мутанты отбирают с частотой 1,57..

Пример 5. ля получения ауксотрофных мутантов используют штамм,itrobacter freundii 467/pNTF59.

Способ получения ауксотрофных мутантов такой же, как и в примере 1, различия состоят в том, что частота транспозиции транспозона Тп 5 в хромосому этого штамма 1,2 10 а ауксотрофные мутанты отбирают с частотой 0,51.

Пример 6. Для получения ауксотрофных мутантов используют штамм

Klebsi lla pneumoniae 62-1/pNTF59.

Способ попучения ауксотрофных мутантов такой же, как и н примере 1, различия состоят в том, что частота транспозиции транспозона Тп 5 в хромосому этого штамма 6,7-10 з, а аук-, сотрофные мутанты отбирают с частотой 0,36Х, Пример 7. ля получения ауксотрофных мутантов используют штамм

Salmoneila typhimurium 487/рИТР59.

Способ получения ауксотрофных мутантов такой же, как и в примере 1, различия состоят в том, что частота транспозицни транспозона Тп 5 в хромосому этого штамма 3,1.10 ", а ауксотрофные мутанты отбирают с частотой 2,07.

Пример 8. Лля получения ауксотрофных мутантов используют штамм

Serratia marcescens В-140/pMTF59, Способ .получения ауксотрофных мутантов такой же, как и в примере 1, раз1599434 6 гается для получения транспозонных о- мутантов у представителей различных = родов и видов семейства. личия состоят в том, что ча"тота транспозиции транспозона Тп 5 в хр мосому этого штамма соответствует

; 2,0 10 -э а ауксотрофные мутанты оть ь

5 бирают с частотой 0,4_#_.

Таким образом, предлагаемая плазмида pMTF59 проявляет температурную нестабильность при 37 ьСь что позволяет с высокой эффективностью вводить 10 транспозон Тп 5 (или Тп 9) в клетки любого штамма семейства Fntегоbacteriaceae и осуществлять транспозонный мутагегез с целью получения необходимых ауксотрофных мутантов. Предлагаемая плазмида pMTF59 по сравнению с известными имеет следующие преимущества: не может реплицироваться в бактериях при 37 С, поэтому для отбора мутантов нет необходимости исполь- 20 зовать температуру 43 С, что значительно распиряет круг штаммов семейства Fntегоbacteriaceae, которые можно использовать для транспоэонного мутагенеза с помощью данной плазмиды; 25 обеспечивает высокую частоту транспоэиции (доходящей до 1,3 .10 - ) транспозонов в хромосому новых бактериальных штаммов и отбор необходимых ауксотрофных мутантов. Плазмида pMTF59 может быть использована для получения мутантов не только с помощью транспозона Тп 5, но также и второго транспозона (Tn 9), входящего в состав данной плазмиды. Плазмида pMTF59 предла/

Формула изобретения

Плазмидная П!К рМТГ59, предназначенная пля транспозонного мутагенеза бактерий семейства Fntегоbacteriaceae молекулярной массой 40,8 М1ь,. и размером 61,2 т.п.н., содержащая плазмиду рМ?8 мол.м. 35,1 Мр и размером 52,7 т.п.н., в которой Sma I—

FcoI471 участок мол.м. 4,6 Mg u размером 6,9 т.п.н., с уникальным сайтом для эндонуклеазы рестрикции

EcnI471, ответственен на репликацию и температурную нестабильность в бактериях семейства Fntегоbacteria сеае; — транспозон Тп 5 мол,м. 3,9 Mg и размером 5 8 т,п.н.; транспозон Тп 9 мол.м. 1,8 Mg и размером 2,638 т.п.н.; — генетические маркеры: — ген Km (Tn 5) — устойчивость к канамицину; — ген Cm"(Tn 9) — устойчивость к хлорамфениколу; ген Sm " — устойчивость к стрептомицину; конъюгативна и может передаваться широкому кругу хозяев бактерий.

Составитель С. Бандрин

Техред М.Моргентал Корректор К. Король

Редактор Л. Веселовская

Заказ Зt23

Тираж 494

Подписное

ВКИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при rKHT CCCp

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðoä, ул. Гагарина, 101