Способ определения активности @ -галактозидазы

 

Изобретение относится к методам контроля микробиологической продукции и может найти применение в молочной и пищевой промышленности, а также в медицине. Целью изобретения является повышение точности, упрощение способа и экономия реактивов. Подготавливают опытную и контрольную пробу. Для этого взвешивают навеску фермента с точностью ±0,001 г и растворяют в определенном объеме дистиллированной воды. 1 мл полученного раствора вносят в 4 мл 5%-ного раствора лактозы. После перемешивания отбирают контрольную пробу. Оставшийся раствор (опытная проба) инкубируют при 30±1°С в течение 30-90 мин. После инкубирования определяют температуру замерзания опытной и контрольной проб и затем по формуле определяют активность фермента: A=2655,2(T<SB POS="POST">0</SB>-T<SB POS="POST">K</SB>)/T<SP POS="POST">.</SP>A, где A - активность фермента β-галактозидазы, ед/г

2655,2 - константа для 5%-ного раствора лактозы

T<SB POS="POST">0</SB> - температура замерзания опытной пробы, °С (абсолютная величина)

T<SB POS="POST">K</SB> - температура замерзания контрольной пробы, °С (абсолютная величина)

T - время выдержки инкубирования опытной пробы, мин

A - количество исследуемого фермента β-галактозидазы, взятого в реакцию, г. 1 табл.

00K)3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) С 12 О 1/00, С О! N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCKOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ и

l;", .

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4362047/30-13 (22) 13,01.88 (46) 23.10.90. Бюл. N - 39 (71) Литовский филиал Всесоюзного научно-исследовательского института маслодельной и сыродельной промышленности (72) Г.В.Гармене, P.Ю.Поцюте ,и В.В.Вайткус (53) 577.15.08 (088.8) (56) Евтихов П.Н. Методы определения

Pi-галактозидазной активности. — Ферментная и спиртовая промьллленность, 1986, Р 5, с.15-19.

Куликова А .К., Летунова Е.В. Метод определения активности Р-галактозидазы с лактозой в качестве субстрата.—

Прикладная биохимия и микробиология, 1984, )1 - 1, с. 133-138. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

Р-ГАЛАКТОЗИ7!А3bI (57) Изобретение относится к методам контроля микробиологической продукции и может найти применение в молочной и пищевой промышленности, а также в. медицине. Целью изобретения является

Изобретение относится к методам контроля микробиологической продукции и может найти применение в молочной и пищевой промьллленности, а также в медицине, Цель изобретения — повьлление точности, упрощение способа и экономия реактивов.

Способ осуществляют следующим образом.

Подготавливают опытную и контрольную пробу. Для этого взвешивают на2 повышение точности, упрощение способа и экономия реактивов. Подготавливают опытную и контрольную пробу. Для этого взвешивают навеску фермента с точностью +0,001 r и растворяют в определе ином объеме дистИллированной в оды. 1 мл полученного рас.твора вносят в 4 мл 5Х-ного раствора лактозы.

После перемешивания отбирают контрольную пробу. Оставшийся раствор (опытная проба) инкубируют при 30«-1 С

B течение 30-90 мин. После инкубирования определяют температуру замерзания опытной и контрольной проб и затем по формуле определяют активность фермента: А = 2655,2 (Т вЂ” Т„)/

t. а, где А — активность фермента

P-ãàëàêòoçèäàçû, ед/г; 2655,2 — константа для 57.-ного раствора лактозы;

Т вЂ” температура замерзания опытной о пробы, С (абсолютная величина);

Т к — температура замерзания контрольной пробы, С (абсолютная величина);

t — время выдержки инкубирования опытной пробы, мин; а — количество исследуемого фермента Р-галактозидазы, взятого в реакцию, г.1 табл. веску фермента с точностью «0,00! г, растворяют в определенном объеме дистиллированной воды. 1 см полученного раствора вносят в определенный объем

57.-ного буферного раствора субстрата (лактозы). После перемешивания смеси отбирают контрольную пробу. Затем ос- . тавшийся раствор (опытная проба) инкубируют при 30 1, С в течение 3090 мин. После инкубирования определяют тел«пературу замерзания опытной (Т ) и контрольной (Тк) проб на тер1601121

35 ометровом криоскопе или на электроном криоскопе и затем по формуле, де учитывают время (t) инкубироваия и количество фермента (а),, опрееляют активность фермента:

2655 2 (То Тк) а где А — активность фермента -галак-, тозидазы, ед/г;

2655,2 — константа для 5%-ного раствора лактозы; — температура замерзания б опытной пробы,, С (абсолютная величина);

Т вЂ” температура замерзания

K о контрольной пробы, С (абсолютная величина); время выдержки инкубиро-. вания опытной пробы, мин;.; а — количество фермента Р галактозидаэы, взятого в реакцию, г.

Время выдержки инкубирования опыт, ной пробы 30-90 мин позволяет опре-! делять активность фермента с помощью температур замерзания опытной и кон, трольной проб. При выдержкеинкубиро-! вания менее 30 мин, например 15 мин, не обеспечивается достаточная точ-. ! ность измерения, вследствие чего по лучается разброс данных и следова-! тельно .снижается точность определе,ния активности. А выдержка более

1 !

90 мин, например 180 мин, уменьшает активность фермента. Определение

tòåìïåðàòóð замерзания опытной и контрольной проб дает возможность прямого определения активности фермента ! путем непосредственного представле40 ния абсолютных значений температур замерзания опытной и контрольной проб в формулу расчета.

Пример 1. Взвешивают 1,000 г э фермента, растворяют в 100 см дистил3 45 лированной воды. Затем 1 см приготовленного раствора вносят в 4 см

5%-ного буферного раствора субстрата (лактозы), перемешивают и отбирают

1 см для контрольной пробы. Оставшийся раствор (опытная проба) инку- 50 бируют при 30 С в течение 30 мин.

После инкубирования определяют температуру замерзания опытной Т и контрольной Т проб, которые соответственно равняются (в абсолютных эна- 55 о чениях) T,= 0,819 С и Т„ = 0,797 С.

Затем активность рассчитывают по формуле: А = 194,7 ед/г.

Активность фермента согласно известному способу 185 ед/г.

Пример 2. До инкубирования аналогично примеру 1, далее опыт-ную пробу инкубируют при 30 С в течение 90 мин. Затем определяют температуру замерзания опытной Т и контрольной Т „ проб, которые соответственно равняются (в абсолютных значениях) То = 0,864 С и Т = 0,797.

?lagee активность рассчитывают по формуле: А = 197,.7 ед/г.

Различие в активности от времени инкубирования в примерах 1 и 2 Составляет 3 -ед/г.

Пример 3. Измерение активности Р --галактозидазы проводят согласно примеру 1, а также известным способом. Результаты измерений приведены в таблице.

Расчетным способом с учетом систематических составляющих погрешности, вносимых на каждой стадии процедуры измерения (за исключением инструментальной случайной погрешности) определяют неисключенную систематическую погрешность. Анализ полученных метрологических характерис тик способов определения активности (-галактозидазы показывает, что общий предел допускаемой погрешности результата составляет 12,4 ед/г, в то время как по известному способу

18,8 ед/г при Р = 0,95 и активности фермента 200 ед/г.

Формула изобретения

Способ определения активности

)-галактоэидазы, предусматривающий подготовку опытной и контрольной проб смешиванием раствора фермента с 5%-ным раствором лактозы, инкубирование опытной пробы с выдержкой..и учет результатов анализа опытной и контрольной проб, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повышения точности, упрощения анализа и экономии реактивов, при инкубировании опытной пробы продолжительность выдержки устаннавливают 30-90 мин, а учет результатов анализа ведут путем определения температуры замерзания опйтной и контрольной проб с последующИм расчетом активности фермента по формуле

A = 2655,2 (Т о — Т ) /t a, ед/г, 1601121 константа для 5Х-ного раствора лактоэы; температура замерзания опытной пробы, C; температура замерзания о контрольной пробы, С; где 2655,2 — время инкубирования контрольной пробы, мин; — количество исследуемого фермента, взятого в реакцию, г.

Т

Т х

Результат измерения

Опыт

Среднее квадратическое отклонение результаДоверительные, границы случайной погрешности результата измерения

Результаты отдельных наблюдений, х; та измерения и х;

А= — - - -— и

$(А) =

5=t. s(A) .

P=0,95

Криоскопический метод

0,939 0,932 0,940

0,947 0,933 0,939

0,935 0,940 0,946

0,930 0,927 0,931

0,929 0,926 0,932

0,929

0,796 0,801 0,801

0,794 0,797 0,791

0,799 0,795 0,797

0,791

О, 00173

0,9390

0,0039

0,00080

0,9291

О, 0019

0,7962

0,0025

0,0028

0,00113

О;00122

Среднее

Спектрофотометрический метод

0,215 0,215 0,185

0,195 0,220 0,215

0,205 0,215 0,220

0,220 0,220 0,225

0,210 О, 125 0,205

0,300 0,290 0 305

0,340 0,305 . 0,305

0,226 0,224 0 218

0,222 0,230

Среднее

0,00275

0,00692

О, 2120

0,3075

0,0059

0,0!70

0 0051

0,0093

0,224

0,00200

0,00389

Составитель А.Семенов редактор Н.Яцола Техред 11.Ходалнч Корректор С.Шекмар

Заказ 3246 Тираж. 504 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035,;1осква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101