Способ отбора штаммов еsснеriснiа coli - продуцентов антигена к88

 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть использовано для определения количества антигена К88 на поверхности бактериальных клеток E. COLI, а также для отбора штаммов эшерихий, характеризующихся повышенной продукцией указанного антигена. Целью изобретения является повышение эффективности отбора штаммов за счет количественного определения уровня продукции антигена К88. Для этого готовят суспензию клеток с концентрацией (1-1,5)<SP POS="POST">.</SP>10<SP POS="POST">9</SP> /мл. Добавляют иммунную сыворотку, меченную 125 J. Инкубируют в присутствии стандартного раствора антигена К88, взятого в количестве 0,02-1 мг/мл, затем дополнительно осаждают комплекс центрифугированием. Определение радиоактивности комплекса, отбор штаммов проводят по количеству антигена на поверхности бактериальных клеток, рассчитанному по изменению радиоактивности клеток при добавлении к ним раствора антигена К88. 3 табл., 1 ил.

„„SU„„1597727

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ н авто сном свидетельств

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (21) 4607246/30-13 (22) 22. 11. <88 (46) 07. 10. 90. Бюл. Р 37 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (72) С.Л.Торский, В.A,Áàíêoâ, Э.А.Светоч, F.È.Ïîïîâ и О.A.Tóãàðèíîâ (53) 576.8.097.2:576.851,48 (088.8) (56) Кэбот Г., Мейер N. Экспериментальная иммунохимия. — M.: Медицина, 1968, с. 106-140.

Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электро1рокуси. рованием, иммуноэлектроАорезом и радиоизотопным методами. — H. .Наука, 1983, с. 244-245.

Методы исследования в имм-нологии./

Под ред. И.Лейковитса, Б.Перниса

8tirm $., 0rskov I., ОгзЪтч Р.

Nature, 1966, v. 209, р. 507-508. (54) СПОСОБ ОТБОРА ИТАММОВ Fscherichia coli-ПРОДУЦЕНТОВ АНТИГЕНА К88 (5?) Изобретение относится к ветери Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и предназначено, в частности, для отбора штаммов эшерихий, характеризующихся повышенной продукцией антигена К88 °

Целью изобретения является повышение эффективности отбора за счет количественного определения уровня продукции антигена К88.

Способ заключается в том, что отбор штаммов-проруцентов антигена К88 ведут по количеству антигена-, определяе(l) . 01 N 33/534, A 61 К 39/02, С 12 0 1/00//(С 12 О 1/00, С 12 2 119 нарной микробиологии и может быть использовано для определен. я количеств" ва антигена К88 на поверхности бактериальных клеток Г.coli, а также для отбора штаммов эшерихий, характеризующихся повышенной :родукцией указан. ного антигена. Целью изобретения является повышение эАЛективности отбора штаммов за счет количественного определения уровня продукции антигена К88. Для этого готовят суспензию клеток с концентрацией (1-1,5) х 10 /мл. Добавляют иммун9 ную сыворотку, меченную ™Х. Инкуб руют в присутствии стандартного раствора антигена К88, взятого в количестве 0,02-1 мг/мл, затем дополнительно осаждают комплекс центрифугированием. Определение радиоактивности комплекса, отбор штаммов проводят по количеству антигена на поверхности бактериальных клеток, рассчитанному по изменению радиоактивности клеток при добавлении к .ним раствора антигена К88, 3 табл, 1 ил. мого реакцией конкурентного связывания радиоактив номеченных К88 специАических антител, находящихся на поверхности интактных бактериальных клеток, со стандартным К88 антигеном, добавленным в инкубационную смесь.

На чертеже изображен график отношения радиоактивностей бактеркальных клеток в зависимости от количества добавленного в пробу ст1апдзртного антигена К88.

15977?7

Проверка специАичности меченных иммуноглобулинов.

Пример 1. Способ отбора штаммов Fscherichia cali — продуцентов антигена К88 достоит из нескольких стадий: выделе ние анти гена, получение радиоактивномеченных анти-К88 иммуно5 глобулинов, проверка специАичности меченных иммуноглобулинов, измерение продукции антигена К88.

Выделение антигена К88.

Антиген К88 выделяют по методу

Стирма. Клетки F..ñîli РМ1, выращенные при 37 С на питательном агаре, о смывают забуАеренным физиологическим раствором (0,15 М NaCl, 0,04 М

Иа НРО,рН 7,4) и разводят до титра

4 х 10 "кл/мл. Суспензию инкубируют

20 мин при 60 С, затем клетки осаждают центриАугированием (10 мин, 60008), а супернатант выдерживают

72 ч при 4 С. Полученный раствор центриАугируют (20 мин, 6000g) для отделения образовавшегося осадка, затем доводят рН в нем до 5 3 одномолярной уксусной кислотой и выдерживают ночь при 4 С. Осадок антигена К88 собирают центриАугированием и растворяют в забуАеренном Аизиологическом растворе.

Чистоту препаратов контролируют с помощью диск-электроАореза в полиакриламидном геле с SDS. Концентрацию антигена К88 определяют по Лоури. Калибровочную кривую строят относительно бычьего сывороточного альбумина.

Получение радиоактивномеченных анти-К88 иммуногл обулинов .

СпециАическую анти-К88 сыворотку получают пятикратной иммунизацией кроликов путем внутреннего введения антигена КЯ8, растворенного в забуАеренном Аизиологическом растворе, в количестве 0,5; 1-0; 2,0; 3,0;

4 О мг с интервалом между инъекциями антигена 7 дн.

Иммуноглобулины из сыворотки вы-! деляют осаждением 33%-ным раствором сульАата аммония и последующей хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе в натрийАосАатном буАере (0,0175 И рН 6,3).

Иммуноглобулины метят радиоактивным Л по методу Остермана. В работе используют иммуноглобулины с удельной радиоактивностью 10 имп/мин х х мкг.

СпециАичность меченных иммуноглобулинов проверяют по способности их связываться с клетками К88 — позитивного штамма Г.coli (штамм РИ1, выращенный при 3700) и KR8 — негативного штамма (штамм С6ОО и штамм РИ1, выра— щенный при 18 С)

В полиэтиленовые пробирки объемом

1,5 мп вносят в натрий-АосАатном буАере (0,4 И, рН 6,0 буАер А) 1,5 миллиарда бактериальных клеток и

100 мкл меченных иммуноглобулинов.

Объем смеси доводят буфером А до

600 мкл и смесь инкубируют 1 ч при комнатной температуре, после чего клетки осаждают центриАугированием (1 мин, 8000g), Осадок ресуспендируют с 1 мл буАера А, переносят в новую пробирку и опять центрифугируют.

Процедуру отмывания клеток от несвязавшейся радиоактивности повторяют дважды. Радиоактивность осадка определяют на гАмма-счетчике.

Результаты определения специфичности меченных иммуноглобулинов представлены в табл. 1.

Как показывают полученные результаты, радиоактивность связавшаяся с клетками штаммов F,collq не синтезирующими антеген К88 (С600 и РИ1, выращенный при 180С), находится на уровне Аона, В то же время радиоактив нос ть, ре гист рируемая на . К88 клетках, в 15 раз превышает этот уровень, что свидетельствует о специАичности меченных О иммуноглобулинов, Измерение продукции антигена К88 . штаммом Г.coli КЭ-8, выращенным на

1 плотной питательной среде.

Клетки. штамма культивируют на питательном агаре при 37 С. Через 18-20 ч роста клетки смывают буфером А. Концентрацию клеток в суспензин определяют Фотометрически.Для определения количества антигена К88 на поверхности клеток в полиэтиленовые пробирки объемом

1,5 мл вносят по одному миллиарду исследуемых бактериальных клеток, ресуспендированных в буфере А. Затем в пробы добавляют антиген К88 в количестве от 0 до 400 мкг и буАер

А до общего объема 500 мкл. Смесь перемешивают и выдерживают 15 мин при комнатной температуре. Затем добавляют по 100 мкл меченных < Ë анти-К188 иммуноглобулинов. Смесь инкубируют 1 ч при комнатной темпе1597727 ря туре, Отмивяние клетом от несвязявшихся иммуноглобулинов и определение Нх радиоактивности проводят как описано при получении рядиоак5 тнвно меченних иммуноглобулинов. Количество меченных антител н пробе (100 мкл) подбирают тяк, чтобы все молекулы специфических иммуноглобулинов могли связаться с антигенами бактериальних клеток. Учитывая баланс н пробе иммуноглобулина и антигена

К88, получают следующие зависимости числа регистрируемых импульсов радиоактивности от количества добавленного белка К88:

Б

I (1) о Б+ Х где I< — радиоактивность пробы в отсутствие в ней стандартного янтигена К88 (конт— рольний образец);

Ig — радиоактивность ТТрН добав— ленин н пробу Х мкг стандартного янтигеня К88;

Б — количество янтигеня К88 н пробе,связанного с бактерияльними клетками.,мкг.

Эту зависимость преобразуют к виду

ЗО

То Х

+ (2)

I, Б х

Полученные для штамма E.coli КЭ-S данные, преобразованные по формуле (2), представлены гряАически на чер— теже. По оси ябцисс ня этой Аигуре отложено количество добавляемого стандартного янтигеня К88, а по оси ординат — отношение радиоактивного счета контрольного образца к радио- 4О активному счету образца, н который добавлен антиген К88. Данные подтверждают справедливость предложенной модели: отношение радиоактивности образцов (IО ..„) лропорцио 4 нально количеству добавляемого антигеня К88. Количество антигена К88 (мкг), связанного с бяктерияльными клетками, внесенными н инкубационную смесь, равно котангенсу угла наклона прямой на этом гряАике, или

Б (3) с х

Таким образом, 10 клеток штамма

КЭ-8 продуцируют 1?5 мкг белка К88.

Усреднение результатов по шести независимым опытам дает 120 + 20 мкг

9 на каждые 10 клеток.

Пример ?, Выбор режима центрифугировяния для осяждения и отмывки клеток от неснязявшейся радиоактивной метки.

ФосАатний буфер, концентрацию бактериальних клеток и меченную иммунную сыворотку используют те же, что в примере

К 100 MKJI суспензии бактериальных клеток штамма PI 11, виращенного при

37 С и находящегося н центриАужных микропробиркях объемом 1,5 мл, до. бавляют 100 мкл меченной сыворотки и 400 мкл буАера. Полученную смесь инкубируют 1 ч и осаждают клетки центриАугировянием ня микроАуге (ускорение 80008). Нядосядок отбрасывают, а осадок суспендируют в 1 мл фосфатного буАеря, переносят в новую пробирку и подсчитывают его радиоактивность. Затем клетки вновь осаждают, переносят в следующую пробирку и подсчитывают радиоактивность.

В табл 2 приведены данные о радиоактивности бактериальных клеток после первого и второго центриАугирований при разном времени центрийугирования.

Данные табл. 2 показывают, что клетки F..coli полностью осаждаются при центриАужном Аакторе (произведение ускорения на время центриАугировяния) большем, чем 8000g мин.

II р и м е р 3. Отбор штаммов

Е.coli с повышенной продукцией антигена К88 проводят следующим образом.

Выращивание бактериальных клеток на плотной питательной среде проводят как описано при измерении продукции антигена К88.

В жидкой питательной среде (бульоне Хоттингера) клетки выращивают при

37 С 18- 20 ч при интенсивной аэрации (в 700 миллилитроные колбы с отбойниками добавляют по 100 мл среды и инкубируют на качалке при

120 об/мин), Свежевыращенные клетки осаждают центриАугированием (10 мин, 6000g), ресуспендируют в буАере А и фотометрированием измеряют концентрацию клеток, Количество антигена К88 на поверхности бактериальных клеток определяют, как описано в примере 1.

Результаты сравнительной оценки штаммов F.,coli с разным количеством антигена К88 представлены в табл. 3.

Результаты табл. 3 свидетельствукл что различные К88-позитивные штаммы

1597727

25

Таблица 1.Температура

Радиоактивный счет осадка, имп/мин выращивания ч.

Лтамм

2500 + 200

150 + 50

170 + 50

РИ1 (К88+)

Рп1 (K88+)

С600 (К88 ) .37

18

Таблица 2

Время центрийугирования, мин

Образец

) 15

1 5

Исходный счет образца, имп/мин

Счет осадка после первого центрийугирования, имп/мин

Счет осадка после второгo центриЖугирования, ймп/мин

124427

95188

117542

6728

8231

6300

5057

5717

5007

Е.coli, выращенные как на плотной, так и в жидкой питательных средах, различаются по количеству продуцируемого ими антигена К88 более чем в 10 раз. Это свидетельствует о целесообразности селекции производственных штаммов по уровню синтеза ими антигена К88.

Все указанные в табл. 3 штаммы являются продуцентами антигена К88, однако при изготовлении, например, вакцины с одинаковым протективным эААектом количество биомассы штамма

Р99 необходимо в 14-20 раз меньше, чем штамма КС421.

Таким образом, используя предложенный способ, можно определять количество антигена К88 на поверхности клеток Е.coli и осуществлять отбор эшерихий с повышенной продукцией антигена К88 ° Такие штаммы необходимы для производства корпускулярных вакцин и лечебных сйвороток против колибактериоза, а также для выделения химически чистого антигена К88.

<Ь о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ отбора штаммов Eschcrichia coli-.продуцентов антигена КЯЯ, включающий приготовление суспензии клеток исследуемого штамма в Аиэиоло— гическом растворе, внесение иммунной сыворотки, инкубацию с последующим отбором штаммов по образованию иммунного комплекса, о т л и ч а ю ш и и с я: тем, что, с целью повышения зфАективности отбора за счет количественного определения уровня продукции антигена К88, суспензию клеток готовят в концентрапии (1

1,5) -10 клеток/мл, в качестве иммунной сыворотки используют сыворотку, меченную 3, инкубацию проводят в присутствии стандартного раствора антигена К88, взятого в количестве

0,02 — 1 мг/мл, дополнительно осаждают полученный комплекс центриАугированием и определяют его радиоактивность, а отбор штаммов IIpoBOJTRT по количеству антигена на поверхности Клеток, рассчитанному по изменению радиоактивности клеток при добавлении к ним раствора антигена К88.

1597727

Та 6 ли ца 3

Количество антигена К88, синтезируемого клетками (мкг на

10 микроб. кл) "

I 1таммьi и

На плотной питательной B жидкой питательной среде среде

90 + 22 результатч,за исключением отмеченных; получены усреднением данных двух — шести опытов;

+4 — нет,лнн 1>: °

Уоо ЯОО 300 ®

Составитель Г.Соболева

Редактор А.Иандор Техред M.Дидык Корректор Н.Король

Заказ 3049 Тираж 528 Подписное

BHHH IH Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

K3 — 8

КЗ-10

РИ1.

РД-25

Р99

КС421

0147: К88ас

РИ-3

НВ101 (р Т20)

08:K88ac

120 + 20

210 + 13

420 + 60

300 + 50

840 + 80

60 + 14

700 + 200

440 + 100

350 + 40

420 + 50

450+

270 + 110

60+ 30

1000 +

320 + 30