Способ исследования апо-в-липопротеинов в сыворотке крови

 

Изобретение относится к области биологии и медицины, а именно биологической и медицинской химии, и может быть использовано для диагностики. Цель изобретения - повышение точности исследования за счет увеличения числа белковых фракций, идентифицируемых в составе апо-В-липопротеинов, и сохранение нативности апобелков при одновременном упрощении способа за счет сокращения числа трудоемких операций. Способ заключается в том, что одновременно проводят электрофорез двух проб нативной сыворотки и пробы сыворотки, из которой предварительно удаляют апо-В-липопротеины, затем окрашивают на белок электрофореграммы пробы, лишенной апо-В-липопротеинов, и одной пробы нативной сыворотки и на углеводы вторую пробу нативной сыворотки. Сравнивают электрофореграммы, окрашенные на белок, и выявляют апо-В-липопротеины. Сравнивают электрофореграммы нативной сыворотки, прокрашенные на белок и углеводы, и определяют нагруженность фракций апо-В-липопротеинов углеводами. Способ позволяет выявить соотношения между углеводными и белковыми компонентами в апо-В-липопротеинах при разных формах патологии.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК. ()9) « (ll) 280 А1

Щ) С 01 N 27/269 33/68

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ.) 1

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4342220/30-14 (22) 11.12.87 (46) 30.10.90. Бюл. N 40 (71) Белорусский государственный институт усовершенствования врачей (72) В.С.Камышников и В.Г.Колб (53) 612.016(088.8) (56) F.lovson J. Biochemistry, 19859

v. 24, р. 1569-1578. (54) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ АПО-В-ЛИПОПРОТЕИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (57) Изобретение относится к области биологии и медицины, а именно к биологической и медицинской химии, и может быть использовано для диагностики. Цель изобретения - повышение точности исследования за счет увеличения числа белковых фракций, идентифицируемых в составе апо-В-липопротеинов, и сохранение нативности апобелков при одновременном упрощеИзобретение относится к биологии и медицине, а именно к биологической и медицинской химии, и может быть использовано для диагностики.

Цель изобретения — повышение точности способа за счет увеличения числа белковых фракций, идентифицируемых в составе апо-В-липопротеинов (ЛП), и сохранения нативности апобелков при одновременном упрощении способа за счет сокращения числа трудоемких операций.

Способ осуществляется следующим обра зом.

2 нии способа за счет сокращения числа трудоемких операций. Способ заключается в том, что одновременно проводят электрофорез двух проб нативной сыворотки и пробы сыворотки, из которой предварительно удаляют апо-Влипопротеины, затем окрашивают на белок электрофореграммы пробы, лишенной апо-В-липопротеинов, и одной пробы нативной сыворотки и на углеводы вторую пробу нативной сыворотки.

Сравнивают электрофореграммы, окрашенные на белок, и выявляют апо-В, липопротеины. Сравнивают электрофореграммы нативной сыворотки, прокра-. шенные на белок и углероды, и определяют нагруженность фракций апо-Влипопротеинов углеводами. Способ позволяет выявить соотношения между углеводными и белковыми компонентами в апо-В-липопротеинах при разных формах патологии.

Одновременно проводят электрофорез двух проб наивной сыворотки и пробы сыворотки, из которой предварительно удаляют апо-В-липопротеины.

Затем окрашивают на белок электрофорограммы пробы, лишенной апо-Влипопротеинов, и одной пробы нативной сыворотки и на углеводы вторую пробу нативной сыворотки. Сравнивают электрофорограммы, окрашенные на белок, и выявляют апо-В-липопротеины. Сравнивают электрофс(тограммы нативной сыворотки, прокрашеннь(е на белок и углеводы, и определяют нагруженность

1603280 фракций апо-В-липопротеинов углеводами.

Пример. К 0,5 мл сыворотки (плазмы) крови добавляют 0,04 мл гепарина (1000 ИЕ/мл) и 0,05 мл раствора хлористого марганца (2 моль/л).

После получасовой экспозиции пробы в ледяной бане и последующего ее центрифугирования в течение 30 мин 10 при 3000 g отбирают пипеткой 0,05 мл надосадочной жидкости (т.е. сыворотки, лишенной апо-В-содержащих липопротеинов) и производят диск-электрофоретическое исследование спектра 15 белков, фракционированных в столбиках полиакриламидного геля.

Способ диск-электрофоретического фракционирования белков (гликопротеинов) сыворотки крови и супернатанта, 20 не содержащего апо-В-ЛП.

Реактивы. Исходные реагенты: 1 н.

НС1, ТРИС, тетраметилэтилендиамин (ТЕИЕД), метиленбисакриламид (БИС или

МБА), персульфат аммония рибофлавин, 25 сахароза, уксусная кислота ледяная", 1 н, раствор КОН, 1 моль/л раствора ортофосфорной кислоты.

Схема получения исходных растворов для полимеризации геля. 30

Раствор 1: рН 8,9, 1 н. НС1 — 48 мл;

ТРИС - 36,6 r, ТЕНЕД - 0>23 мл, вода - до 100 мл.

Раствор ?: акриламид — 30,0 r, БИС - 0,8 г вода - до 100 мл.

Раствор. 3: аммоний надсернокислый (персульфат аммония) - 0,14 г, водадо 100 мл (раствор должен храниться не более 7 сут в холодильнике).

Раствор 4; рН 6,8; 1 н.HC1 — 48 мл, 4О

ТРИС - 5,98 г, раствор ортофосфорной кислоты - 25,6 мл, вода - до 100 мл.

Раствор 5: акриламид - 10,0 г,БИС2,5 г; вода — до 100 мл.

Раствор 6: рибофпавин - 0,004 r, 4> вода - до 100 мл.

Раствор 7: сахароза - 40,0 r, вода " до 100 мл.

Растворы могут сохраняться в течение нескольких недель (до 4 мес. в темных склянках в холодильнике при

+4 С).

Схема приготовления мелкопористого разделяющего геля с концентрацией по акриламиду 40 г/л; рН 8,9 (смесь

1 ш): 1 объем раствора 1, 2 объема

55 раствора. 2, 1 объем бидистиллированной воды, рН 8,9. К полученной смеси добавляют равный обьем раствора 3.

В конечном итоге схема приобретает следующий вид: 1 объем раствора 1, 2 объема раствора 2, 1 объем бидистиллированной воды, рН 8,9, 4 объема раствора 3.

Схема приготовления крупнопористого концентрирующего геля: 1 объем раствора 2; 2 объема раствора 5;

1 объем раствора 6; 4 объема раствора 7 °

Схема приготовления основного раствора для электродного буфера: .

ТРИС - 6,0 r> глицин - 28>8 г, вода дистиллированная - до 1000 мл, рН

8,3,Перед употреблением разбавлять в 10 раз.

Схема приготовления раствора красителя: бромфенол синий - 0,001 r, вода дистиллированная - до 100 мл.

Схема приготовления красящего раствора - фиксатора: амидо-черный

10 В - 1,0 r раствор уксусной кислоты концентрации 10 г/100 мл — до

100 мл.

Консервирующим раствором - дифференциатором является раствор уксусной кислоты концентрации 7 г/100 мл.

Оборудование. Для проведения аналитического диск-электрофореза в

ПААГ используются отечественные приборы, предназначенные для этой цели:

ПЭФА - 1, некторые другие и аппараты венгерской фирмы "Реанал" (модель

Р 69).

Ход выполнения методики. Хранимые в холодильнике реактивы перед исследованием вынимают и выдерживают некоторое время при комнатной температуре для их согревания. Стандартные стеклянные трубочки с отшлифованными концами укрепляют в специальной подставке согласно инструкции, прилагаемой к прибору. Далее приготовляют раствор мелкопористого геля с рН 8,9. Основные растворы (1 объем смеси 1 и 1 объем раствора 3) тщательно смешйвают в небольшой склянке. С целью предотвращения образования в процессе полимеризации геля воздушных пузырьков, в значительной мере препятствующих процессу разделения, желательно удалить иэ основных растворов воздух, для чего можно испольэовать подключенный к склянке водоструйный или другой отсос.

В стеклянные трубочки пипеткой вносят по 2 мл раствора мелкопорисДля выявления гликопротеинов столбики полиакриламидного геля фиксиру45 ют в течение ночи в водном растворе изопропанола (250 г/л), затем 2 отмывают дистиллированной водой и погружают на 50 мин в раствор йодной кислоты концентрацией 10 г/л, приго50 товленной в 0,2 моль/л раствора л ацетата натрия. После повторного отмывания дистиллированной водой (в течение 1 ч) столбики полиакриламидного геля помещают на 50 мин в реактив Ыиффа. Затем столбики геля обрабатывают в течение 30 мин (лучше

3 раза по 10 мин) свежеприготовленным 5 г/л раствором метабисульфита натрия и отмывают дистиллированной

1

I того геля, слепя за тем, чтобы в нег . не попали пузырьки воздуха . На поверхность этого раствора наслаивают

0,2-0,3 мл дистиллированной воды или разведенного буфера . Для ускорения 1олимеризации трубки освещают лампой дневного света. По истечении 30

40 мин процесс завершается, о чем можно судить по слабому нагреванию стеклянных трубочек, а также по образованию хорошо различимой границы между полиакриламидным гелем и водной фазой. Быстрым движением руки осторожно стряхивают с геля наслоенную жидкость (ее можно удалить из трубок и с помощью фильтровальной бумаги).

При приготовлении раствора крупнопористого (верхнего) геля. отсасывать воздух из,. раствора необязательно, однако готовящуюся смесь желательно предохранять от воздействия яркого света (из-за чувствительности к нему рибофлавина). Стеклянные трубочки ополаскивают 0,1-0,2 мл раствора мономера (для полного удаления других компонентов) и в каждую колонку пипеткой вносят 0,2 мл раствора мономера, используемого для приготовления крупнопористого концентрирующего геля. Затем известным способом наслаивают 0,1-0,2 мл бидистиллированной воды.

Полимеризацию геля осуществляют за счет фоточувствительного катализатора рибофлавина. Поэтому штативы с гелями располагают около ультрафиолетовой лампы мощностью 250-500 Вт иди другого источника яркого света но завершении полимеризации верхнего слоя (на что требуется около получаса) нанесенную жидкость сливают с крупнопористого геля, а геле вые трубочки ополаскивают раствором крупнопористого мономера, ранее при готовленного для анализа.

Сформированный (объем 0,2 мл) диск, соприкасающийся с мелкопористым гелем, производит концентрирующий эффект.

В колонку (трубку) вносят 0,01 м анализируемой сыворотки и. наслаивают электродный буфер, разбавленный в 1О раз. В случае, если пробу вносят вместе с крупнопористым мономером, полимеризацию его желательно проводить при ультрафиолетовом осве щении. При применении же в качестве разбавителя биологической жидкости

6 раствора мономера с сахарозой (раст-, вор 7) полимеризации не требуется.

Верхнюю часть прибора стыкуют с

5 нижним буферным резервуаром, который предварительно заполняют разбавленным в 10 раз буферным раствором.

Ухудшающие электрический. контакт воз. душные пузырьки удаляют с концов тру10 бочек, входящих в буферный раствор нижнего резервуара, многократным, но осторожным встряхиванием раствора или иным способом (например, шприцем с иглой, заполненным электродным бу15 фером). Осторожно приливают в верхний резервуар десятикратно разбавленный буферный раствор. Камеру желательно поместить на время проведения электрофореэа в холодильник.

20 В течение первых 15 мин электрофорез проводят при силе тока, не превышающей 2 мА на каждую отдельную трубочку (для этого нужно установить необходимое напряжение) . Затем силу

25 тока следует увеличить до 5 мА на каждую трубочку. Ток пропускают до тех пор, пока окрашенное кольцо буфера не достигает уровня, отстоящего на 5 мм от нижнего края столбика полиакриламидного геля (на что уходит

1 - 1,5 ч) . После завершения электрофореза гелевые трубочки вынимают из верхнего резервуара. Гель из стеклянных трубочек можно легко удалить, перемещая стальную иглу в промежутке между гелем и трубочкой под слоем дистиллированной воды. Извлеченный гель погружают на 20-30 мин в раствор-фиксатор, внесенный в пробирки.

После окрашивания гели обеспечивают электрофоретически с помощью специального для этого приспособления.

3280

1 водой. Гели хранят в растворе уксусной кислоты концентрации 70 г/л.

Гелеграммы белков и гликопротеинов одной и той же пробы сыворотки (плазмы) сканируют на микроденситометре. Денситограммы диск-электрофореграмм обрабатывают количественно (путем нахождения площадей пиков, составляющих отдельные Фракции белков и гликопротеинов, их суммации и оп. Ределения относительного количест.венного содержания) предварительно осуществив качественную идентификацию белков и гликопротеинов.

Полученные денситограммы дискэлектрофореграмм трех проб одной и той же сыворотки (плазмы) крови,две из которых составляют спектр белков нативной сыворотки (плазмы) и сыворотки (плазмы), лишенной апо-В-ЛП, а третья - спектр гликопротеинов нативной сыворотки (плазмы), сопоставляют, обращая внимание на исчезнувшие (по сравнению со спектром сыворотки, лишенной апо-В-ЛП) белки нативной (цельной) сыворотки или плазмы крови (они являются апо-В-липопротеинами) и на изменение соотношения ,между белковым и углеводным компонентами в выявленных зонах белков.

При сравнении между собой дискэлектрофореграммы белков супернатанта плазмы и диск-электрофореграммы белков плазмы видно отсутствие в спектре белков супернатанта.плазмы ряда белковых фракций, обнаруживаемых в плазме крови между линией старта и трансферрином.

Более полное представление об этом дают денситограммы соответствующих . диск-электрофореграмм белков супернатанта плазмы, лишенной апо-В-ЛП и самой плазмы.

Следовательно, используя предлагаемый способ получения апо-В-ЛП, становится возможным не только выявить их место в диск-электрофоретическом спектре белков, но и судить об изменении (если таковое имеет место) соотношения между углеводными и белковыми компонентами в апо-ВЛП при разных формах патологии.

Использование изобретения позволяет повысить точность исследования за счет увеличения числа белковых фракций, идентифицируемых в составе апо-В-липопротеинов, а также за счет двухкратного снижения ошибки измерения, упростить способ за счет сокращения трудоемких операций (в

1,3 раза) и времени исследования (в

4. раза); сохранить нативность исследуемых апобелков.

Формула

Способ исследования апо-В-липопротеинов в сыворотке крови, включающий осаждение апо-В-липопротеинов и идентификацию апобелков дискэлектфорезом в полиакриламидном геле, отли чающийся тем, что., с целью повышения точности способа за счет увеличения числа белковых фракций, идентифицируемых в составе апо-В-липопротеинов, и сохранения нативности апобелков при одновременном упрощении способа за счет сокращения числа трудоемких операций, одновременно проводят электрофорез двух- проб нативной сыворотки и пробы сыворотки, из которой предварительно удаляют апо-В-липопротеины, затем окрашивают на белок электрофореграммы пробы, лишенной апо-В-липопротеинов, и одной пробы нативной сыворотки и на углеводы вторую пробу нативной сыворотки, сравнением электрофореграмм, окрашенных на белок, выявляют апо-Влипопротеины, а сравнением электрофореграмм нативной сыворотки, прокрашенных на белок и углеводы, определяют нагруженность Фракций апо-В-липопротеинов углеводами.