Способ определения содержания креатинина, креатина и саркозина в биологической жидкости

 

Изобретение относится к биохимии и может найти применение в клинической диагностике. Цель изобретения - повышение чувствительности способа. Содержание креатина, креатинина и саркозина в биологической жидкости определяют путем инкубации 3-х проб с двумя реагентами при соотношении по объему проба: реагент 0,05 - 1, при этом реагент 1 содержит буфер с PH 7,9, 4-аминоантипирин 0,8 ммоль/л, пероксидазу 2 ед/мл, в соответствующем случае саркозиноксидаду - 6,5 ед/мл и дополнительно холат натрия 5 ммоль/л, 2,4,6-трибром-3-оксибензойную кислоту 8,6 ммоль/л, железо-синеродистый калий 10 мкмоль/л, LUTENSOL @ ON 50 0,5 мас/об.%, липазу 2 ед/мл, аскорбатоксидазу 10 ед/мл и в соответствующем случае креатинаминогидролазу 12 ед/мл, а реагент II содержит в соответствующем случае саркозиноксидазу 6,5 ед/мл и креатинами - ногидролазу 25 ед/мл с последующим измерением интенсивности окраски в полученной смеси при 546 нм в сравнении со стандартным образцом, при этом используют CHAINIA PURPUROGENA DSM - 43156, CHAINIA OCHARACEAE DSM - 43155, STREPTOMYCES FLOCCULUS DSM - 40327. Применение способа позволяет повысить более чем в три раза чувствительность способа определения креатина, креатинина и саркозина по сравнению с прототипом. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

09) (11) рц G 01 N 33/68, 33/70

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТ У

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ пРи Гннт сссР (21) 4027546/30-14 (22) 28.05;86 (31) Р 3519218. 6 (32) 29.05.85 (33) DE (46) 30.07.90. Бюл. Ф 28 (71) Берингер Маннхайм ГмбХ (DH) (72) Ульрих Майр, Ханс Меллеринг, Иоахим Зидель и Ханс Зайдель (DE) (53) 612.015(088.8) (56) Патент Франции Р 2405299» кл. С 12 D 13/10, 1979. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ

КРЕАТИНИНА, КРЕАТИНА И .САРКОЗИНА В

БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ (57) Изобретение относится к биохимии и может найти применение в клинической диагностике. Цель изобретенияповышение чувствительности способа.

Содержание креатина, креатинина и саркоэина в биологической жидкости определяют путем инкубации 3-х проб с двумя реагентами при соотношении по

Изобретение относится к биохимии и может найти применение в клинической диагностике.

Цель — повышение чувствительности способа.

Пример 1. Культивирование

Chainia purpurogena DSM-43156.

В колбе для встряхивания организм., культивируют в сложной среде указан2 объему проба: реагент 0,05-1, при этом реагент I содержит буфер с рН

7,9, 4-аминоантипирин 0,8 ммоль/л, пероксидаэу,2 ед/мп, в соответствующем случае саркозиноксидазу 6,5 еп/мп и дополнительно холат натрия 5ммоль/л, 2,4,6-трибром-3-оксибенэойную кислоту 8,6 ммоль/л, железо-синеродистый калий 10 мкмоль/л, Lutensol® ON

50-0,5 мас./об. Х» липаэу 2 ед/мл, аскорбатоксидазу 10 ед/мп и в соответствующем случае креатинаминогидролазу 12 ед/мп» а реагент II содержит в соответствующем случае сархозиноксидазу 6,5 ед/мл и креатинаминогидролазу 25 ед/мл с последующим измерением интенсивности окраски в полученной смеси при 546 нм в сравнении со стандартным образцом, при этом используют Chainia purpurogena

DSM-43156, Chainia ocharaceae

DSM-43155, Streptomyces flocculus

DSM-40327. Применение способа позволяет повысить более чем в три раза чувствительность способа определения креатина, креатинина и саркозина по сравнению с прототипом. 3 табл. ного состава:5 г дрожжевого экстракта; 3 г пептона (типично переваренный); 2 r NaC1; 0,24 r МАЗО, 7Н О;

0,014 r CaClz к 7Н О; 2 r глюкозы;

10 r саркозина; 1 л воды; рН 7,0. Выращенная при 28 С культура через,30 ч показывает. активность около 400 V/ë.

Пример 2. Выделение саркозиноксидаэы Е.С.1.5.3.1 из Chainia purpurogena.

1582993

2,9 кг влажной массы Chainia purpurogena DSM-43156 (получена в результате обработки 95 л культуры) суспен-, дируют в 15 л фосфатного буферного раствора с концентрацией 20 ммоль/л, рН 8,0, после чего суспензию в течение 4 ч выдерживают при 25 С с 4 r лизоцима. К обработанной суспензии прибавляют такое количество 10Х раст- 10 вора полиэтиленимина (Polymin-G-20//

//BASF), чтобы произошло полное отделение нуклеиновых кислот и посторонних белков. Саркозиноксидазу, которая

Находится в надосадочной жидкости,, связывают слабоосновным анионоообменником (ДЕАЕ-Сефадекс), после чего элюируют с возрастающим солевым градиентом. Прибавлением сульфата аммония элюат доводят до концентрации 20

0,6 моль/л. Фермент присоединяют к вменил-сефароэе, после чего проводят

Хроматографирование с возрастающим градиентом сульфата аммония (указанный фосфатный буферный раствор). Элю- 25 ат, содержащий более 4 V/ìã белка, прибавлением твердого сульфата аммония доводят до концентрации

2,4 моль/л. Осадок обрабатывают

0,1 моль/л фосфатным буферным раство- 30 ром, после чего саркозиноксидазу дополнительно очищают пропусканием че рез молекулярные сита (Sephacryl-S-200, Pharmacia). Очищенный фермент имеет удельную активность 5,5 7/мг„ 35

Пример 3. Выращивание Chainia

ochraceae DSM-43155.

Организм культивируют во встряхиваемой колбе в комплексной среде следующего состава: 5,00 г/л дрожжевого 40 экстракта; 3,00 г/л пептона (типично переваренный); 2,00 г/л NaC1;

0,24 г/л МАМБО, "7Н О; 0,014 г/л

СаС1. < «7Н О; 2,00 г/л глюкозы;

10,00 г/л саркозина; рН 7,0. Разводи- 45 мая при 28 С культура через 30 ч дает активность саркозиноксидазы около

200 мочевины/л. . Пример 4. Выделение саркозиноксидазы из Chainia ochraceae.

2,6 кг влажной массы СЬф пда осЬга сеае (DSM-43155) иэ 81 л культуры, (200 мочевины/л, разведенной по примеру 3) суспендируют с 14 л 20 ммоль/л фосфатного буфера, рН 8,0 и растворяют в течение 4 ч при 35 С с 3,8 г лизоцима. После этого, как описано в примере 2, проводят негативное осаждение полиэтиленимина и хроматографиро4-Аминоантипирин, ммоль/л

2,4,6-Трибром-"

-3-оксибензойная кислота, ммоль/л

Fe(CN) 6 мкмоль/л

Na-.õîëàò, ммоль/л @

Lutenso1 0N 50, (вес/об.) a

Креатинаминогидролаза, ед/мл

Саркозиноксидаза по примеру 2, ед/мл

0,8

8,6

0,5

12

6,5 вание ДЕЛЕ-Сефадекс. Элюат смешивают с сульфатом аммония до 3,0 моль/л, рН 8,0. Выпавшую саркозиноксидазу центрифугируют и перенесят в фосфатный буфер (20 ммоль/л, рН 8,0). Частично очищенный фермент имеет удельную активность 2,1 мочевины/л.

Пример 5. Выращивание Streptomyces flocculus DSM-40327.

Организм культивируют во встряхиваемой колбе в комплексной среде следующего состава: 5,00 г/л дрожжевого экстракта; 3,00 г/л пептона (типично переваренный); 2,00 г/л NaC1; 0,24 г/л

M@SO< x 7Н О; 0,014 r/ë CaC1< 7Н О;

2,00 г/л глюкозы; 10,00 г/л саркозина; рН 7,0. Выращиваемая при 28 С культура через 30 ч делает активность. саркозиноксидазы около 30 мочевины/л .

Пример 6. Выделение саркозиноксидазы из Streptomyces flocculus.

3,1 кг влажной массы Streptomyces

flocculus .(DSM-40327) из 98 л культуры (30 мочевины/л, по примеру 5) растворяют по аналогии с примером 4 и выделяют фермент через осаждение полиэтиленимином, хроматографию PFAE-Сефадекс и осаждение сульфатом аммония. Частично очищенный фермент имеет удельную активность около 0 35 мочевины/мг протеина.

Пример 7. Применение саркозиноксидазы для определения креатинина. Реактив I. Реактив для определения контрольного значения пробы: (Фосфат калия (рН 7,9), ммоль/л, 150 (или 0,1 моль/л

ТЕ$/КОН, рН 7,9) 1582993 6

1 см; измерение по отношению к воздуху (см. табл. 2) .

Е = (Е,-Е з)-(Е,-Е,1. (E w Е э) (Eq Ет) °

150 . (или 0,1 моль/л

TES/КОН, рН 7 9) 4-Аминоантипирин, ммоль/л

2,4,6-Трибром-3-оксибензой25

0,8

150 (или 0,1 моль/л

TES/ÊOÍ, рН 7,9) 35

4-Аминоанти-. пирин, ммоль/л

2,4,6-Трибром-2-оксибенэой0,8

10

Пероксидаза, ep,/ìë 2

Липаэа, ед/мл 2

Аскорбатоксидаза, ед,/мл 10

Реактив (II ) (пробный реактив): реактив I плюс 25 ед/мл креатинамидогидролазы.

Осуществление теста (смесь для определения): длина волны 546 нм; Т =

25 C (или 37 C); толщина слоя — 1 см; измерение по отношению к воздуху (см. табл. 1).

Инкубирование проводят в течение

20 мин при 25 или 37О С, а затем измеряют экстинкции Е (— Е

Расчет концентрации креатинина в пробе: через совместно введенный воде ный стандартный образец (2 мг/дл .

Для этого стандартный образец применяют в такой же смеси для определе-. ния, что и пробу.

Il p и м е р 8. Применение саркоэиноксидазы для определения саркозина °

Реактив I (реактив для определения холостой пробы):

Фосфат калия (рН 7,9), ммоль/л ная кислота, ммоль/л 8,6

К Fe (CN) < ммоль/л

Холат натрия, мкмоль/л . 5 45

Lutensol ®

ON 50, (вес/об.)% 0,5

Пероксидаэа, ед/мл 2

Аскорбатоксидаза,ед/мл 10

Липа э а, ед/мл 2

Реактив II (реактив для проб): реактив I + 6,5 ед/мл саркозиноксидазы.

Осуществление теста (смесь для определения): длина волны 546 нм; Т

= 25 С (или 37 С); толщина слоя =

Инкубируют в течение 20 мин при

25 или 37О С, затем измеряют экстинкции Е1-Ес

Расчет концентрации саркозина в пробе: через совместно введенный водный стандарт (2 мг/дл). Стандарт при этом должен вводиться в определяемую смесь как проба. .Пример 9. Применение саркозиноксидазы для определения креатина.

Реактив I (реактив для определения холостой пробы):

Фосфат калия (рН 7,9),ммоль/л ная кислота, ммоль/л 8,6

К Ее(СН), мкмоль/л .10

Холат натрия, ммоль/л 5

Lutensol

ON 50, (вес/об.)ф 0,5

Саркозиноксндаза согласно примеру 2, ед/мл 6,5

Пероксидаэа, ед/мл 2

Липа за, ед/мл 2

Аскорбатоксидаэа, ед/мл 10

Реактив II (реактив для проб): реактив I + 12 ед/мл креатинамидогидро-. лаэы.

Осуществление теста (смесь для определения): длина волны 546 им; Т =

25 С (или 37 С); толщина слоя =

= 1 см; измерение по отношению к воздуху (см. табл. 3).

Инкубируют в течение 20 мин при

25 или 37 С затем измеряют экстинкции Е >-Е

1582993

Таблица 1

Реактив

II контКонтрольное значе

Реактив I контрольное значеЗначение пробы, мл

Показатели ние пробы, мл рольное значение,мл ние, мл

1,00

1,00

Реактив I

Реактив II но

Проба

1,00 1,00

0 05

0 05

0 05

0,05

Таблица 2

ЗначеРеактив I Холостое холостое значение значение, пробы, мл мл

Реактив II холостое

Пока за тели ние пробы, МЛ значение, МЛ

1,00

1,00

Реактив

Реактив

Проба

1,00

1,00

0 05

0 05

0,05

0,05

Расчет концентрации креатина в пробе: через совместно введенный водный стандарт (2 мг/мл).

Стандарт при этом должен вводиться в определяемую смесь как проба, Формула из обретения 10

Способ определения содержания креатинина, креатина и саркозина в биологической жидкости путем инкубации пробы с реагентом, содержащим буфер- 15 ное вещество, 4-аминоантипирин, пероксидазу и саркозиноксидазу с после дующим измерением интенсивности окраски полученной смеси в сравнении со стандартным образцом, о т л и ч а ю- 20 шийся тем; что, с целью увеличения чувствительности способа, исполь зуют два реагента, инкубацию трех

I проб проводят при соотношении (по объему) пробы: реагент 0,05-1, реагент I содержит буфер с р11 7,9, 4-аминоантипирин 0,8 ммоль/л, пероксидазу

2 ед/мя, в соответствующем случае саркозиноксидазу,6 5 ед./мли дополнительно холат натрия 5 ммоль/л, 2,4,6-трибром-3-оксибензойную кислоту

8,6 ммоль/л, железо-синеродистый калий 10 мкмоль/л, Lutensol ON 50

0,5/ (мас./об,), липазу 2 ед./мл, аскорбатоксидазу 10 ед./мл и в соответствующем случае креатинаминогидролазу

12 ед./мл, а реагент II содержит в соответствующем случае саркозиноксидазу 6,5 ед./мл и креатинамияогид-. ролазу 25 ед./мл, измерение интенсивности окраски проводят при 546 нм, при зтом используют саркозиноксидазу из Chainia purpurogena DSM-43156, Chainia ochraceae.DSM-43155, Streptomyces flocculus DSM-40327.!

1582993

Та блица 3

Показатели

Реактив II холостое

Значение пробы, значение, мл

1,00

1,00

0,05

0,05

Составитель Т. Малютина

Техред Л.Олийнык Корректор Н; Король

Редактор О. Спесивых

Ю

Заказ 2099 Тирал(530 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óàãîðîä, ул. Гагарина,101

Реактив I

Реактив II

Н 0

Проба

Реактив I холостое значение, мл

1,00

0,05

Холостое значение пробы, мл

1,00

0,05