Способ отбора физиологически активных веществ, снижающих гиперактивность сукцинатдегидрогеназы

 

Изобретение относится к фармакологии и позволяет эффективно отбирать новые лекарственные средства и характеризовать известные фармакологические препараты по новому важному показателюограничению гиперактивности сукцинатдегидрогеназы. По предлагаемому способу это свойство определяется по ингибированию дыхания митохондрий при окислении сукцината, причем с целью повышения чувствительности предлагается использовать митохондрии сердца голубя и проводить измерения в присутствии аденозидифосфата калия или 2,4-динитрофенола. 5 ил.

ÄÄSUÄ„1587451

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

Ai щ) G 01 N 33/68

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTGPCHGMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ с

Диаграммы (фиг. 1) представляют сравнение скоростей дыхания митохондрий сердца голубя, окисляющих сук- С цинат (кривая 1) и НАД-зависимый субстрат глутамат (кривая 2), и мито- 2 хондрий печени крысы, окисляющих сукцинат (кривая 3); стрелками обоз- (,Д начены моменты внесения веществ, Я) стимулирующих дыхание митохондрий— аденозиндиАосфата калия (АДФ) и „ф .2,4-динитрофенола (ДНФ). Диаграммы е (фиг. 2 — 5) представляют скорости дыхания митохондрий сердца голубя, окисляющих сукцинат (в том числе в присутствии АДФ и ДНФ), в контроле (кривые 1) и в присутствии тестируе-. мого вещества — обзидана. В концентрации 5 .104И на 1 мг белка и митохонд- Ф рий экстракта подорожника, добавляе- Ь мого в количестве 0,02 мл на 1 мг белка, тиабенлазола в концентрации

10 4М íà t Mr белка и мебендазола в концентрации 5 10 Н на 1 мг белка митохондрий (кривые 5), а также скоГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4469971/30-14 (22) 29.07.88 (46) 23,08.90. Бюл. К - 31 (71) Институт биологической физики

АН СССР (72) М.Н.Кондрашова и Е,Б.Окон (53) 6 1?.0 15 (088.8) (54) СПОСОБ ОТБОРА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ AKTHBHFIX ВЕЩЕСТВ, СНИЖАИЩ1Б ГИПЕРАКТИВНОСТЬ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ (57) Изобретение относится к Аармакологии и позволяет эАфективно отбирать новые лекарственные средства

Изобретение относится к фармакологии и предназначено для тестирования Аизиологически активных веществ, способных нормализовать окислительно-восстановительный обмен, и может быть использовано в фармакологии и в научных исследованиях, направленных на изучение регуляции энергетического метаболизма.

Пелью изобретения является разработка способа отбора Аизиологически активных веществ, ограничивающих гиперактивность сункцинатдегидрогеназы.

По способу скрининга веществ путем измерения скорости дыхания митохондрий в присутствии и в отсут-ствии тестируемого вещества согласно изобретению измерения проводят на митохондриях, выделенных из сердца голубя, в присутствии сукцината.

На Аиг. 1 — 5 представлены диаграммы скоростей дыхания митохондрий сердца голубя и митохондрий печени крысы.

2 и характеризовать известные фармакологические препараты по новому важному показателю — ограничению гиперактивности сукцинатдегидрогеназы.

По предлагаемому способу это свойство определяется по ингибированию дыхания митохондрий при окислении сукцината, причем с целью повышения чувствительности предлагается использовать митохондрии сердца голубя и проводить измерения в присутствии аденозидиАосфата калия или 2,4- динитрофенола. 5 ил.

158745 1 рости дыхания митохондрий печени крысы, окисляющих сукцинат в контроле (кривые б) и в присутствии тех же самых тестируемых веществ (кривые 7), 5

Пример 1. Испытывали влияние веществ обзидана (пропранолола), применяемого при ишемических состояниях сердца, экстракта подорожника, широко используемого противовоспалитель- 1ð ного средства, и антигельминтных препаратов тиабендазола и мебендазола на скорости дыхания митохондрий сердца голубя и печени крысы.

Митохондрии сердца голубя выделяли из двух сердец голубя (вместе) методом двойного центрифугирования.

Для этого изолированные сердца погружают в охлажденную до О С среду выделения. Состав среды выделения:

0,32 M сахароза, 0,001 И ЭДТА, 30 мМ трис- НС1, рН 7,5. Ткань сердца мелко нарезали ножницами, продавливали через пресс с отверстиями 1 мм, полученную массу гомогениэировали в среде выделения, взятой в отношении к весу ткани сердца как 8:1. Все операции проводили в холодной комнате при 0-2 С охлажденными инструментами. о

Крупные фрагменты клеток и ядер осаж-3р дали при 600 8 в течение 10 мин. Супернатант сливали и вновь центрифугировали при 12000 g 10 мин, Осадок после второго центрифугирования сус° ïåHäèðoâàëè в охлажденной среде суспендирования (0,32 М сахароза, 1 мМ трис-НС1, рН 7,5) из расчета 1 мл на

10 г сырой ткани сердца, Митохондрии печени крысы выделялись по методу Н.Н,Кондрашовой, E.A.ÃðèãoðåHKî. Для этого продавленную через пресс ткань печени гомогенизировали в среде выделения, взятой в отношении к весу ткани печени 8:1.Первое центрифугирование проводили при

500 8 7 мин, затем супернатант вновь центрифугировали при 4500 g 15 мин.

Полученный осадок суспендировали в среде выделения (1 мл среды на 10 г исходного веса ткани печени) . Все процеду— ры проводили при 0-2 С, о 50

Концентрацию кислорода в процессе дыхания измеряли полярографически с помощью платинового электрода в закрытой ячейке объемом 1 мл. Измерения проводили полярографом LP7

55 (ЧССР) .

Среда инкубации митохондрий сердца голубя содержала 0,3 М сахароэу, мМ ЭЛТА, 3 MM КН РО, 0,03 мМ трис-HCl pH 7,5. Концентрация сукцината 5 мИ. Содержание митохондриального белка в ячейке 2 мг в 1 мл, Среда инкубации для митохондрий печени крысы содержала О, 15 M сахарозу, 50 мИ KCl, 3 мМ КН РО4, 5 мМ трисНС1, рН 7,5. Концентрация сукцината

5 мИ. Содержание белка митохондрий

4мгв1мл.

Перед внесением митохондрий в ячечку для регистрации потребления кислорода регистрировали ток, соответствующий табличному содержанию кислорода в среде инкубации митохондрий сердца голубя или печени крысы при 25 С

500 нг-ат. 0 в 1 мл.

Затем в ячейку вносили митохондрии в количестве, соответствующем указанному содержанию белка, и регистрировали изменение содержания О в про2 цессе окисления сукцината. По ходу процесса производили добавки АДФ до конечной концентрации 150 мкИ и ДНФ до конечной концентрации 20 мкМ для митохондрий сердца голубя и 50 мкМ для митохондрий печени крысы, вызывающие увеличение скоростей дыхания митохондрий (моменты внесения добавок обозначены стрелками). Скорости дыхания рассчитывали как производную содержания О в измерительной ячейке, т.е. KRK количество кислорода, поглощенного за 1 мин на 1 мг белка митохондрий. Таким образом были получены данные для построения диаграмм скоростей дыхания митохондрий сердца голубя, окисляющих сукцинат (кривые 4) и митохондрий печени крысы, окисляющих сукцинат (кривые 6).

Экспериментальные данные для построения диаграмм скоростей дыхания митохондрий сердца голубя и печени крысы, окисляющих сукцинат, в присутствии обзидана быпи получены аналогично за исключением того, что перед внесением митохондрий в измерительную ячейку вносили обзидан в

/ конечной концентрации (кривые 5 и 7, фиг. 2) .

Как видно из этих кривых, обзидан в концентрации 5 1О 4М на 1 мг белка митохондрий ингибирует дыхание митохондрий сердца голубя (кривая 5) в присутствии АДФ на 58 < 2Х, а дыха,ние в присутствии ДНФ вЂ” на 73 i 3,27. с достоверностью р (0,01 в серии иэ шести опытов. Дыхание митохондрий пе1587451

Ъ чени крысы практически не ингибирует1 ся (кривые 6 и 7} обзиданом в указанной концентрации. По данным, полученным ранее, значительное увеличение концентрации обзидана может вызвать и

J ингибирование окисления сукцината митохондриями печени. Такая зависимость влияния на окисление субстратов от концентрации характерна для многих веществ.

Следовательно, обзидан является веществом, ограничивающим гиперактивность сукцинатдегидрогеназы. Отсутствие er о влияния на скорости дыхания митохондрий печени в указанной концентрации говорит о его не1 токсичности.

Л р и м е р 2, В качестве другого испытуемого вещества, брали экст- 2р ракт подорожника, который готовили следующим образом. 10 г сухого листа помещали в термос, заливали кипящей водой (100 мл) и экстрагировали в течение 12 ч. Полученный экстракт 25 отфильтровывали, Для устранения ионов кальция, которые маскируют эААект ингибирования, экстракт обрабатывали смолой "Дауэкс, при этом он значительно обесцвечивался. Экстракт 30 добавляли к суспензии митохондрий в количестве 0,02 мл на 1 мг белка митохондрий. С этим веществом повторяли все процедуры, описанные для обзидана. Диаграммы скоростей дыхания

35 митохондрий сердца голубя и митохондрий печени крысы, окисляющих сукцинат в присутствии экстракта подорожника, представлены на Аиг. 3 (кривые 5 и 7) .

Как видно из этих диаграмм, дыха-. 40 ние митохондрий сердца голубя в присутствии АЦФ ингибируется этим препаратом на 65,7 ф 1,27. (достоверность р ( (0,001 по критерию Вилкоксона в серии из 16 опытов) . Дыхание митохондрии 45 печени крысы в данной концентрации практически не ингибируется. Следовательно, экстракт листьев подорожника является средством, ограничивающим гиперактивность сукцинат— дегидрогеназы . Увеличение концентрации действующего начала экстракта подорожника в несколько раз вызывает ингибирование скорости окисления сукцината и митохондриями печени .крысы приблизительно на 307, как это характерно для обзидана.

Пример 3. Процедура была повторена для тиабендазола и затем для мебендазола. Результаты этих исследований представлены на Аиг. 4 и 5 соответственно. Как видно из сравнения кривых 4 и 5 (Аиг. 4), дыхание митохондрий сердца голубя под действием тиабендазола в концентрации

-Ф

10 М на 1 мг белка митохондрий в присутствии АДФ ингибируется на

71 + 1,2Е, а в присутствии ДНФ вЂ” на

73 + 1,57 с достоверностью р (0,01 по критерию Вилкоксона в серик из шести опытов. Дыхание митохондрий печени тормозится существенно мень E ше в присутствии той же концентрации тиабендазола (фиг. 4, кривые 6 и 7), Следовательно, этот препарат эААективно ограничивает гиперактивность сукцинатдегидрогеназы. Однако наличие ингибирующего влияния на митохондрии печени говорит о токсичности тиабен.— дазола, что подтверждается клинической практикой.

Пример 4. Исследовали мебендазол, как описано. Мебендазол оказывает ингибирующее влияние в более высокой концентрации. В при-Ф сутствии 5 t0 М мебендазола на 1 мг белка митохондрий (Аиг. 5) дыхание митохондрий сердца голубя снижено на

49 + 3,67 в присутствии ЛДФ и на.

54 + 3,57, в присутствии ДНФ. Достоверность р (0,01 в серии из шести опытов по критерию Вилкоксона. Следовательно это вещество также является ограничивающим гиперактивность сукцинатдегидрогеназы. При этом также ингибируются скорости дыхания митохондрий печени крысы, но в меньшей степени,чем тиабендазолом,что говорит о его меньшей токсичности. Это согласуется с клиникой.

Таким образом, приведенные примеры показывают, что проверенные лекарственные вещества, применяемые при состояниях, сопровождающихся гиперактивацией суцинатдегидрогеназы, ограничивают окисление сукцината в митохондриях сердца голубя, особенно в присутствии АДФи ДНФ.Влияние этих . веществ на скорости дыхания митохонд рий печени крысы выражено в значительно меньшей степени или вовсе на наблюдается. Следовательно, предлагаемый способ може быть использован для отбора веществ, ограничивающих патологическую гиперактивность сукцинатдегидрогеназы.

1587451

200

I O0

Сравнение воздействия тиабендазола и мебендазола — веществ, относящихся к одному классу антигельминтных препараTnB,ïîêàýûâàåò,÷òî количественные оценки, получаемые предлагаемым способом, 5 согласуются с терапевтической активностью этих препаратов.

Практическое значение предлагаемого способа состоит в том, что он позволяет делать качественный отбор новых веществ или расширять возмож— ности использования уже имеющихся препаратов по новому чувствительному показателю — влиянию на активность сукцинатдегидрогенаэы, являющуюся важной характеристико энергетического обмена. Способ позволяет охарак1 теризовать уже известные препараты и с этой точки зрения, что сделает более обоснованным назначение препаратов и уточнит механизм их действия.

Важно отметить, что вещества, отобранные таким способом, обладают 25 именно ограничивающим действием на сукцинатдегидрогеназу, снижая гиперактивное окисление сукцината, но слабо влияя на окисление сукцината в норме, что может быть проверено на митохондриях печени крысы. Если препарат оказывает значительное влияние и на окисление сукцината митохонд-, Ц риями печени крысы, то это говорит о его токсичности, как это показано ! в случае с тиабендазолом (фиг. 4) .

Подобранные по показателю степени ограничения гиперактивности сукцинатдегидрогеназы препараты должHbl найти, кроме известных показаний, широкое применение при профилактике острого стресса, при адаптации к работе в тяжелых условиях, при состояниях связанных с гипоксией и ишемией, особенно при выходе из этих состояний, при введении организма в состояние гипотермии и в Ряде других случаев.

Формула и з о б р е т е н и я

Способ отбора Аизиологически активных веществ, снижающих гиперактивность сукцинатдегидрогеназы, включающий измерение скорости потребления кислорода митохондриями сердца голубя в присутствии сукцината в условиях энергизации и деэнергизации митохондрий на Аоне и в отсутствии( тестируемого вещества и при уменьшении скорости потребления кислорода в присутствии тестируемого вещества,его относят к Аизиологически активным веществам, снижающим гиперактивность сукцинатдегидрогенаэы.

t58745l

1ЕО

120 ео

4Ьр.с

120 ео

Фиг,3

1587451

160 ио

4О

240

160

120 ао

Фиг Х

Составитель A.Àãóðååâ

Техред Л.Серц<окова Корректор М.йарон и

Редактор Н.Бобкова

Заказ 2418 Тираж 509 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Реушская наб., д. 4/5

Производственно-изца гальс<4«й комп««;.т "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 1<) I