Производные гидроксиперфторизопропилдинитрофенилгидразина, ингибирующие реакционные центры фотосистемы двух растений

 

Изобретение касается производных гидразина, в частности производных гидроксиперфторизопропилдинитрофенилгидразина формулы I __→ -NH-NR₁R₂, где R=CH₃; R₁=H; R₂=-C(O)-NH-C₆H₅ или -C(O)-C₆H₅, ингибирующих реакционные центры фотосистемы двух растений, что может быть использовано в фундаментальных исследованиях функцианальной организации реакционного центра фотосистемы-2 и механизмов фотосинтетического окисления воды и выделения кислорода. Цель - создание новых более активных соединений указанного класса. Синтез ведут обработкой 4-(2¹-метоксиперфторизопропил)-2,6-динитрофенилгидразина фенилизоцианатом или хлористым бензолом в среде бензола или без него при кипячении. Выход, %; т.пл., ^oС; брутто-формула: а) 80; 304-305; C₁₇H₁₃F₆N₅O₆; б) нет; 161-162; C₁₇H₁₂F₆N₄O₆.

Новые соединения специфически подавляют реакции переноса электрона в фотосистеме-2 и не действуют на перенос электрона в фотосистеме-1. 1 ил., 9 табл. Изобретение относится к производным гидразина, конкретно к новым производным гидроксиперфторизопропилдинитрофенилгидразина формулы R-OH-N где R CH₃; R' H'; R" C₆H₅NHCO; C₆H₅CO, ингибирующим реакционные центры фотосистемы двух растений. Целью изобретения является изысканием в ряду ароматических динитропроизводных новых соединений, обладающих более эффективным действием на фотохимическую активность реакционных центров фотосистемы двух растений. П р и м е р 1. К 0,0016 моль 4-(2'-метоксиперфторизопропил)-2,6-динитрофенил- гидразина в 3 мл бензола добавляют по каплям 0,0016 моль фенилизоцианата, кипятят 30 мин, реакционную массу разбавляют гексаном, отфильтровывают кристаллический продукт. Выход 80% (см. табл. 1, соединение I), оранжево-желтый кристаллический продукт, т.пл. 304-305^оС. Найдено, C 40,59; H 2,98; N 13,56. C₁₇H₁₃F₆N₅O₆ Вычислено, C 41,06; H 2,63; N 14,08. ИК-спектр (KBr,ν, см^-1): 1100-1300 (CF); 1340; 1540 (NO₂); 1680 (CO). ПМР-спектр (CD₃CN,δ, м.д.): 9,22 (NH'); 7,80 (NH²); 7,38(NH³); 8,32 (Ar, 2H). П р и м е р 2. 0,0014 моль 4-(2'-метоксиперфторизопропил)-2,6-динитрофенил- гидразина кипятят 5 мин в 5 мл хлористого бензоила. Реакционную массу разбавляют 20 мл гексана, отфильтровывают желтый кристаллический осадок (см. табл. 2, соединение II). Характеристики полученных соединений приведены в табл. 1. Соединения анализируют по их способности инактивировать фотосинтетические цепи переноса электрона на уровне ФС-2 или системы окисления воды и выделения кислорода и фотосистемы 1. Ингибирующее действие соединений I и II на перенос электрона в ФС-2 определяют по из влиянию на фотоиндуцированные изменения выхода флуоресценции хлорофилла ( Δ Ф) фотосистемы 2, связанные с фотовосстановлением первичного акцептора электрона Q_А. При освещении светом ( λ >600 нм) хлоропластов или субхлоропластных препаратов, обогащенных ФС-2, наблюдают флуоресценцию хлорофилла. Функционально различают постоянную (Фо) и переменную ( ΔФ) флуоресценцию. Постоянная флуоресценция испускается хлорофиллом антенны и не связана с функционированием электрон-транспортной цепи (ЭТЦ). При освещении объекта Ф_о не изменяется. Практически вся переменная флуоресценция хлорофилла связана с функционированием реакционного центра (РЦ) фотосистемы 2 (ФС-2). Переменная флуоресценция обусловлена окислительно-восстановительными превращениями Q_A и представляет собой люминесценцию, возникающую в результате рекомбинации зарядов в паре (П680⁺ Фео^-), образующейся в первичной световой реакции (здесь П680 первичный донор электрона ФС-2, Фео феофитин промежуточный акцептор электрона ФС-2). Имеются два состояния РЦ: открытое когда Q_А окислен, РЦ в этом состоянии способен к фотохимической реакции (соответственно выход флуоресценции хлорофилла мал и представлен только вкладом постоянной флуоресценции Ф_о), закрытое когда Q_A восстановлен, РЦ в этом состоянии не способен использовать энергию возбужденного хлорофилла и высвечивают ее в виде переменной флуоресценции (выход флуоресценции возрастает до уровня Ф_макс=Ф_о+ ΔФ). Восстановление Q_A либо при освещении сильным действующим светом, λ >600 нм, либо химически (при добавлении сильного восстановителя дитионита), либо блокируя отток электронов с ФС-2 добавлением соответствующего ингибитора (например, диурона) вызывает возрастание ΔФ, а с другой стороны, реокисление Q-, а, с другой стороны, реокисление Q _A^- посредством усиления оттока электронов с ФС-2, либо при освещении светом, λ >720 нм, возбуждающим ФС-1, либо при добавлении соответствующего акцептора электрона ФС-2 (например, K₃Fe(CN₆) вызывает уменьшение ΔФ, точно также ослабление притока электронов к РЦ фотосистемы 2, при подавлении активности донорной стороны ФС-2, сопровождаются уменьшением величины фотоиндуцированных изменений выхода флуоресценции ΔФ (так как не накапливается восстановленный Q _A^- ), которую можно частично реактивировать экзогенными донорами электронов ФС-2 (например, аскорбатом натрия или MnCl₂). Таким образом, исследуя подавление фотоиндуцированных ΔФ и их реактивацию, судят о функционировании и акцепторного и донорного участков и реакционного центра фотосинтетической электрон-транспортной цепи фотосистемы 2. Помимо этого о функциональной активности фотосистем (ФС-2 и ФС-1) судят, измеряя фотоиндуцированные изменения поглощения ( ΔА), связанные с фотоокислением первичного донора электрона их реакционных центров (П680 до П680⁺ при 680 нм для ФС-2; П700 до П700⁺при 700 нм для ФС-1). Так как практически вся переменная флуоресценция хлорофилла связана с функционированием ФС-2, а флуоресценция хлорофилла ФС-1 незначительная, то ингибирующее действие соединений I и II на перенос электрона в ФС-1 определяют по их влиянию на фотоиндуцированные изменения поглощения ( ΔА) при 700 нм, связанные с фотоокислением первичного донора электрона РЦ фотосистемы 1, П700 до П700⁺ на хлоропластах и субхлоропластных препаратах, обогащенных фотосистемой 1. Измерения фотоиндуцированных изменений выхода флуоресценции хлорофилла приводят на двухлучевой фосфороскопической установке. Величину Фо измеряют, освещая образец слабым зондирующим светом, λ=480 нм, 50 эрг ˙ см-² с^-1, не способным в нормальных условиях вызывать накопление восстановленного Q _A^- Фотоиндуцированные ΔФ измеряют путем дополнительного освещения образца сильным действующим светом, λ >600 нм, 2 ˙ 10⁵ эрг ˙ см^-2 с^-1), вызывающим накопление восстановленного Q _A^- На чертеже показан график влияния ингибиторов на фотоиндуцированные ΔФ в отсутствие и присутствии аскорбата натрия. Кривая 1 (контроль), ΔФ получены без ингибитора и без аскорбата натрия. Кривая 2: сплошная пятьдесят процентов ингибирования соединениями или диносебом (см. табл. 3) без аскорбата натрия; штриховая добавлен аскорбат натрия вплоть до 1 мг/мл. Кривая 3: сплошная девяносто процентов ингибирования соединениями или диносебом (см. табл. 3) без аскорбата натрия штриховая добавлен аскорбат натрия вплоть до 1 мг/мл. Кривая 4 пятьдесят процентов ингибирования диуроном. Кривая 5: сплошная сигнал ΔФ трис-обработанных препаратов ФС-2 (поврежден донорный участок, см. пример 3) в отсутствие экзогенных доноров; штриховая реактивация фотоиндуцированных ΔФ трис-обработанных препаратов добавлением экзогенного донора электрона ФС-2 аскорбата натрия. Δ- включение зондирующего света, возбуждающего флуоресценцию (λ=480 нм, 500 эрг ˙ см^-2 с^-1). Стрелки - включение и выключение действующего света ( λ=600 нм, 2,8 ˙ 10⁵ эрг ˙ см^-2 с^-1) соответственно. Длина оптического пути 10 мм, содержание хлорофилла 10 мкг/мл. П р и м е р 3. Действие вещества I на фотоиндуцированные изменения выхода флуоресценции хлорофилла реакционного центра ФС-2 ( ΔФ) на субхлоропластных препаратах, обогащенных ФС-2 (ДТ-20). Субхлоропластные препараты, обогащенные реакционными центрами (РЦ) фотосистемы 2 и обозначенные ДТ-20, выделяют с помощью 0,4% дигитонина и 0,1% тритона Х-100 из листьев гороха. Использованные субхлоропластные препараты ДТ-20 содержат один РЦ на 100-200 молекул хлорофилла. Опыты проводят в кварцевой кювете, l 10 мм, в среде А, содержащей 15 мМ трис-HCl (pH 7,8) 35 мМ NaCl, 2 мМ MgCl₂. Концентрация хлорофилла в среде 10-20 мг/мл. Непосредственно перед каждым измерением берут 10-20 мл ДТ-20 с исходной концентрацией 2,0 мг/мл и доводят средой А до 2 мл. Маточный раствор вещества I готовят в диметилсульфоксиде (ДМСО) марки х.ч. затем до нужной концентрации доводят средой А. Содержание ДМСО в реакционной среде не превышает 2% В предварительных опытах устанавливают, что наличие в реакционной среде даже 15-20% ДМСО не влияет на фотохимическую активность ФС-2. Измерения фотоиндуцированных измерений выхода флуоресценции хлорофилла проводят на двухлучевой фосфороскопической установке. Сначала регистрируют уровень постоянной флуоресценции (Ф_о), возбуждаемой измерительным светом ( λ= 480 нм, 50 эрг ˙ см^-2 см^-1), а затем фотоиндуцированную ΔФ, вызываемую включением действующего света ( λ >600 нм, 2 ˙ 10⁵ эрг ˙ см^-2 с^-1) (кривая 1). Это значение ΔФ, полученное в отсутствие вещества I, принимают за 100% (т.е. контроль). Данные представлены в табл. 1. J₅₀ для вещества I составляет 3,9 ˙ 10^-7 моль. Действие на фотоиндуцированные ΔФ приведено на чертеже, кривая 2 и 3. П р и м е р 4. Действие вещества 2 на фотоиндуцированные изменения выхода флуоресценции хлорофилла ФС-2. Определение ингибирующего действия вещества II проводят, как в примере 2. Полученные результаты приведены в табл. 2. J₅₀ для вещества II составляет 2,5 ˙ 10^-6 моль. Действие на фотоиндуцированные ΔФ аналогично действию вещества I. П р и м е р 5. Исследование обратимости ингибирующего действия соединений I и II на фотоиндуцированные ΔФ препаратов ФС-2. Как уже отмечалось, уменьшение величины фотоиндуцированных ΔФ можно вызвать не только усилением оттока электронов от первичного восстановленного акцептора электрона Q _A^- добавлением экзогенного акцептора электрона (например, феррицианида или дихлорфенолиндофенола), но и блокированием потока электронов на уровне реакционного центра или нарушением притока электронов к реакционному центру от донорного ФС-2 путем его инактивирования различными обработками (II). Причем, если инактивирование (ингибирование) фотохимической активности ФС-2 происходит на уровне донорного участка и не затрагивает реакционный центр, то внесение экзогенных доноров электрона ФС-2 (например, MnCl₂или аскорбат натрия) вызывает реактивацию (восстановление) активности, близкой к первоначальной (II). Это наблюдается, например, при внесении аскорбата натрия к трис-обработанным препаратом ФС-2 препараты с инактивированным донорным участком (II) (см. чертеж, кривая 5). Измерения фотоиндуцированных ΔФ и их ингибирование проводят, как в примере 3, за исключением того, что соединения I и II вносят в реакционную смесь сразу в концентрации, вызывающей ≈90% инактивирования фотохимической активности ФС-2. Затем в реакционную смесь вносят аскорбат натрия и измеряют изменения инактивированных фотоиндуцированных ΔФ. Полученные результаты приведены в табл. 3. Из табл. 3 видно, что добавление аскорбата натрия в реакционную смесь вплоть до концентрации 1 мг/мл не реактивирует фотохимическую активность препаратов ФС-2, предварительно обработанных соединениями I и II. П р и м е р 6. Действие диносеба (2,4-динитро-6-изобутилфенол, аналог) на фотоиндуцированные изменения выхода флуоресценции хлорофилла ФС-2. Определение ингибирующего действия диносеба проводят, как в примере 2. Полученные результаты приведены в табл. 4. Действие на фотоиндуцированные ΔФ аналогично действию вещества I (см. чертеж, кривые 2 и 3). П р и м е р 7. Действие диурона 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевины (аналог) на фотоиндуцированные изменения выхода флуоресценции хлорофилла ФС-2. Определение ингибирующего действия диурона на субхлоропластных препаратах проводят, как в примере 2. Полученные данные представлены в табл. 5. Из табл. 5 видно, что действие диурона на фотоиндуцированные ΔФ значительно отличается от действия соединений I и II. Внесение диурона в реакционную смесь вызывает возрастание уровня постоянной флуоресценции Фо, возбуждаемой зондирующим светом, и за счет этого одновременное уменьшение величины переменной флуоресценции ΔФ, возбуждаемой действующим светом. П р и м е р 8. Действие соединений I и II на активность ФС-2 в хлоропластах. Хлоропласты выделяют по методике из листьев гороха. Определение ингибирующего действия веществ I и II на активность хлоропластов проводят, как в примере 2. Установлено, что вещества действуют на фотоиндуцированные изменения выхода флуоресценции хлорофилла ФС-2 (ΔФ) в хлоропластах аналогично их действию на ΔФ в субхлоропластных препаратах ФС-2 (см. табл. 6). Действие ингибиторов на фотоиндуцированные изменения выхода флуоресценции хлорофилла реакционного центра ФС-2 (ΔФ). Данные по исследованию действия соединений I и II на перенос электрона в ФС-1 по их влиянию на фотоиндуцированные изменения поглощения ( Δ А) при λ=700 нм, связанные с фотоокислением первичного донора электрона РЦ фотосистемы 1. Изменение Δ А П700 (%) в зависимости от концентрации ингибитора приведены в табл. 7. Из табл. 7 видно, что соединения I и II не оказывают ингибирующего действия на фотоиндуцированные Δ А реакционных центров фотосистемы 1. Диурон, ингибирующий перенос электрона в акцепторной части ФС-2, блокирует реокисление восстановленного первичного акцептора электрона ФС-2 Q _A^- В отсутствие диурона зондирующий свет не способен вызывать накопление восстановленного Q _A^- В присутствии диурона, блокирующего реокисление восстановленного Q _A^- сам зондирующий свет вызывает частичное накопление восстановленного Q _A^- Внесение диурона в реакционную смесь вызывает возрастание уровня постоянной флуоресценции Ф_о, возбуждаемой зондирующим светом, и за счет этого (так как Ф_макс=Ф_о+ + Δ Ф) одновременное уменьшение величины переменной флуоресценции, возбуждаемой действующим светом (см. чертеж, кривая 4). Отсюда видно, что уменьшение величины фотоиндуцированных Δ Ф в присутствии диурона, происходит за счет увеличения Ф_о, вызванного ингибированием переноса электрона по акцепторной стороне ФС-2. В результате проведенных исследований показано, что добавление соединений I и II к препаратам ФС-2 вызывает уменьшение величины Δ Ф, так что сумма Δ Ф_о+ Ф также значительно уменьшается, не изменяя уровень Фо (кривые 2 и 3). Это характерно для подавления или однородной части или непосредственно реакционного центра ФС-2, т.е. по механизму ингибирующего действия соединения I и II значительно отличаются от известного игибитора ФС-2 диурона. Кроме того, внесение экзогенных доноров электрона ФС-2 (например, MnCl₂ или аскорбата натрия) вызывает реактивацию (восстановление) активности, близкой к первоначальной, например, при внесении аскорбата натрия к трис-обработанным препаратам ФС-2 (кривая 5). Если же внесение экзогенных доноров не реактивирует фотохимическую активность, значит инактивирован непосредственно реакционный центр ФС-2. Установлено, что (см. пример 4) внесение аскорбата натрия к предварительно обработанным соединениям препаратам ФС-2 не изменяет их ингибирующего действия. Это показывает, что соединения I и II инактивируют ФС-2 на уровне реакционного центра. Добавление диносеба к хлоропластам или препаратам ФС-2 вызывает уменьшение величины фотоиндуцированных Δ Ф, не изменяя уровень Ф_о, аналогично соединениям (кривые 2 и 3). Добавление аскорбата натрия также не изменяет ингибирующего действия деносеба. Однако соединения I и II обладают более эффективным и специфичным действием на ФС-2, чем диносеб. Ингибирующее действие соединений проявляется при концентрациях, в 50-100 раз меньших, чем концентрации, необходимые для достижения такой же степени ингибирования при воздействии диносебом (см. табл. 5). Расчет показывает, что ингибирование ФС-2 происходит при добавлении одной молекулы ингибитора (предлагаемого соединения) на один РЦ фотосистемы 2. Соответственно в случае диносеба необходимо добавить около 100 молекул на РЦ, это совпадает с литературными данными. Установлено, что внесение соединений I и II в реакционную смесь, содержащую хлоропласты, или препараты, обогащенные ФС-1, не оказывают какого-либо значительного действия на фотоиндуцированные Δ А П700 (см. табл. 7). Спектральные характеристики производных гидроксиперфторизопропилдинитрофенилгидразина и свойства соединений I и II приведены в табл. 8 и 9. Таким образом, полученные данные указывают, что соединения I и II подавляют реакцию переноса электрона в фотосистеме 2 и не действуют на перенос электрона в фотосистеме 1. Таким образом, значительным преимуществом соединений является то обстоятельство, что они специфически в соотношении 1:1 реагируют с РЦ фотосистемы 2. Таким образом, гидроксиперфторизопропилдинитрофенилгидразины, ингибирующие электронный транспорт ФС-2, можно использовать в фундаментальных исследованиях функциональной организации реакционного центра ФС-2 и механизмов фотосинтетического окисления воды и выделения кислорода в качестве эффективных и специфических ингибиторов переноса электрона в фотосистеме двух растений, а также как потенциальные гербициды.

Формула изобретения

Производные гидроксиперфторизопропилдинитрофенилгидразина формулы

где R = CH₃; Rʹ = H; Rʺ = C₆H₅NHCO-; C₆H₅CO-,
ингибирующие реакционные центры фотосистемы двух растений.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6