Штамм культивируемых гибридных клеток животных mus мusсulus l. - продуцент моноклональных антител против альфа- фетопротеина человека

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для определения аль срафетопротеина (АФП) иммунорадиометрическим методом. Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. , продуцирующих моноклональные антитела (МонАТ) к АФП человека и не реагирующих с АФП животных, Ытамм получают гибридизацией клеток миеломы Х63. АИ 8.653 спленоцитами мышей, иммунизированных очищенным АФП человека- Итамм депонирован под ВСКК(И) № 349D. Ытамм культивируют в среде ДМ ЕМ или RPMI 164 Г) с 15% сыворотки эмбриона коровы и стандартными добавками при 5% СО г в воздухе. Клетки пересевают через 3-4 сут с начальной плотностью (1-2)к10 кл/мл. Клетки культивируют in vivo в виде асцитной опухоли у сингенных мышей. Клетки продуцируют монАТ класса IgG1. Титр монАТ в асцитных животных достигает 10 при определении методом EL1SA, с to

ССЮЭ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А3 (19) (11) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4682710/13 .(22) 31.03.89 (46) 28.02.91. Бюл. Р 8 (71) Всесоюзный онкологический научный центр АМН СССР (72) А.К.Язова, А.И.Гусев, А.В. Андреев и F..Ô. Якименко (53) 578.085,23(088,8) (56) 3. Immunob .Meth., 1988, V. 106, р. 19-21. (54) 11ТЫЯ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ГИБРИДНЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L. — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ

АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для определения альфафетопротеина (АФП) иммунорадиометрическим методом. Цель изобретения— получение штамма гибридных культивиИзобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для определения альфа-фетопротеина (АФП) иммунорадиометрическим методом.

Цель изобретения — получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., продуцирующих моноклойальные антитела (МонАТ) к АФП человека и не реагирующие с

АФП животных.

МонАТ штамма реагирует с детерминантой АФП, присутствующей только в АФП.человека, и не связывается с АФ11 мгпи, крысы, теленка, собаки, свиньи и коыки.

Нтамм получают следующим образом.

Мьппей линии BAI.В/с иммуниэируют очищенным препаратом АФП человека. (51)5 С 12 И 5/06, С 12 Р 21/08

1 руемых клеток животных Nus musculus L. продуцирующих моноклональные антитела (МонАТ) к АФП человека и не реагирующих с АФП животных. Ытамм получают гибридизацией клеток миеломы

Х63. Ар 8.653 спленоцитами мышей, иммунизированных очищенным АФП человека.

11тамм депонирован под BGKK(II)

Р 349D. Ытамм культивируют в среде

ДМЕМ или RPMI 16 0 с 15.1 сыворотки эмбриона коровы и стандартными добавками при 51, 00< в воздухе. Клетки пересевают через 3-4 сут с начальной плотностью (1-2)к 10 кл/мл. Клетки культивируют in vivo в виде асцитной опухоли у сингенных мышей. Клетки продупируют монАТ класса IgG1. Титр монАТ в асцитных животных достигает

10 при определении методом ЕЫ$А.

Антиген вь1целяют из смеси сывороток больных с гепатоцеллюлярным раком и тератобластомой методом аффинной хроматографии с использованием кроличьих антител к АФП, конъюгированных с С11Вг-активированной сефарозой 4В. Окончательную очистку антигена проводят методом аффинной хроматографии с использованием кроличьих антител к белкам сыворотки взрослого человека — эту процедуру повторяют дважды, что обеспечивает высокую (более 951) чистоту выделяемого антигена. Чистоту АФП контролируют с кроличьей антисывороткой к белкам сыворотки человека методом двойной иммунодиффузии в геле. Полученный препарат смешивают 1:1 с полным адъювантом Фрейнда. Каждой мыши вво1631076 дят 15 мкг АФП в объеме 0,3 мл в шесть точек, подкожно на спине (4 точки по 0,05 мл) и внутримышечно в задние ноги (2x0,05 мл). Через месяц мыши вводят 75 мкг АФП без адъюванта

Фрейнда внутривенно (0,2 мл) и внутрибрюыинно (0,2 мл). На четвертый день после второго введения антигена берут селезенку и суспензию спленоцитов гибридизуют с мышиной миеломои

Х-63. Ag 8.653. Для этого смесь спленоцитов и миеломы (6,5:1) в виде осадка инкубируют с 3 мл 50%-ного полиэтиленгликоля (И.в.1500) в течение 2 мин, Обработанную смесь клеток высевают в две 96 — луночные пластины без фидера из расчета 4х10 сплено5

r> цитов в лунку или 4,бх10 смеси клеток в лунку. Клетки культивируют в среде ДИЕИ с добавлением 20% лошади ной сыворотки, 2мМ глютамина, 100 мкг/мл гентамицина. Селекцию ги:бридных клеток проводят в культуральной. среде в присутствии гипоксантина а5 (13,6 мкг/мл) аминоптерина (О, 19 мкг/мл) и тимидина (3,9 мкг/мл) . Появление колоний гибридных клеток зарегистрировано на 7 — и день после слияния. На

13-й день после слияния множественные колонии (3-5 на лунку) выросли

ЗО в 100% засеянных лунок. Скрининг проводят иммуноферментным методом с использованием конъюгата кроличьих антител I@G мыши с пероксидазой хрена, В 99% лунок в супернатантах обнаруже — 35 на .специфическая анти-АФП активность.

Клонирование и субклонирование пози.тивных гибридом проводят методом лимитирующих разведений, осуществляя посев гибридом в количестве 3,1 и

0 5 клеток в лунку с заранее приготовленным фидером, В качестве фидера используют клетки перитонеального экссудата мышей BALB/с (5х10 клеток в лунку). Клонирование проводят на культуральной среде, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки.

При реклонировании отмечается 100% позитивных клонов, Полученный штамм. гибридных клеток 50 обозначен D10-84 и депонирован под номером BCKK(II) М 349D.

Нтамм характеризуется следующими свойствами.

Кулвтуральные свойства.

Гиб ридому куль тивир уют в ср еде (рН 7, 2) ДЫЕИ или КРИТ . 1 640, содер-жащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мИ глютамина, 1ОО мкг/мл

ГE нтам1п1ина, при 3 7 С в прис уTc "ии

5/ СО (в пластинах) или без СО (в плотно закрытой посуде) . Для выращивания штамма можно испо п зовать стеклянную или нластиr«>вyю посуду, Во флакон емкогтью 25 смз засевают в 7 мл ростовой среды 5x10 — 10 клеток штамма D10-84. Пассирование проводят один раз в 3-4 дня той же до— зой клеток (без подсчета клеток их рассеивают из одного флакона на три) .

Титр антител в культуральной среде при определении иммуноферментным ме— тодом равен 2х10

Для культивирования in vivo мышам

BALB/с, сенсибилизированным пристаном (0,5 мл внутрибрюшинно) за 7 дней до прививки гибридом, вводят внутрибрюшинно 5х10 -10 клеток штамь 7 ма D10-84 в 2 мл среды RPHI с гента— мицином. Асцитическую жидкость забирают у живых мышей. по мере ее накопления, повторяя забор асцита у одной и той же мыши не менее 3 раз.

Асцитный штамм перевивают на свежих, 7 мышей (5х10 -10 клеток на мышь), проводя не более трех пассажей. В пулах асцитов, полученных от разных животных и в разных взятиях, титр антител при определении имчунофермептным методом достигает зна ения 10

Продуктивность штамма. В 1 мл кульгуральной среды содержится не более

10-20 мкг/мл антител, а в ""ñöèòè÷åñкой жидкости не менее 5 мг/мл антител.

Контаминация. Контаминация бактериями и грибами в штамме не обнаруже-! га.

Криоконсервирование. Клетки штамма ресуспендируют в среде для замораживания, состоящей из эмбриональной телячьей сыворотки,,П. 1ГЛ или КРИТ

1640 и диметилсульфоксида (5:4:1).

5х10 клеток штамма смешивают с 1 мл такой среды на холоде в пластиковых пробирках, для чего последние держат на льду и сразу же после программного замораживания материала (1 /мин) о помещают в хранилище с жидким азотом.

Хранение в жидком а зоте в течение нескольких лет обеспечивает почти

90%-ную выживаемость клеток (визуальная оценка), Клетки штамма вщ,ержива— о, ют хранение и при -70 С, Но короткое во времени(до 1 мес.). Размораживание штамма проводят в вс ;.явой бане

1(> 31(7

Твердой подложкой служит поверхность лунок полихлорвиниловых плат.

Для иммобилизации МонАТ в лунках инкубируют смесь асцитических жидкостеи

D10-84 и С2-84 в 0,08 М растворе

11а НРО.(.(200 мкл) при комнатной температуре в течение 9 — 12 ч. Конечное разведение асцитических жидкостей

Р10-84 и С2-84 в лунках равно

1:2000-1:3000. После удаления содержимого лунки двукратно промывают забуференным физиологическим раствором (ЗФР), рН 7,3-7,5, содержащем 1-2Х лошадиной сыворотки (ЗФР-ЛС). Блокировку свободных участков полихлорвинила проводят с помощью третьей порции ЗФР-ЛС (230 мкл) в течение 1,52 ч при комнатной температуре. После

2-3-кратной промывки под струей водопроводной воды лунки с иммобилизирован40

45 (!1»! 37 (. в тече((не 2 — 3 мин, пос ле о, чего клетки отмывают центрифугнрованпем от среды для замораживания и переводят в обычную культуральную среду.

Характеристика целевого продукта. МонЛТ, продуцируемые штаммом

Л10-84, относятся к субклассу 1801.

Константа связывания антител штамма

D10-84 с ЛФП равна 1,8х10 л/моль— о определение проведено жидкойазным конкурентным радиоиммунологическим методом. Взаимодействие МонЛТ с ЛФП определяется иммуноферментHblM и радиоиммунологическим методами, а также методами иммуноизотахойореза на ацетатцеллюлозной мембране и смешанной преципитации в геле. МонАТ П10-84 связывается с АФП, находяшимся в раст воре и иммобилизованным на твердой 20 фазе, а также и в том случае, когда само МонЛТ D10-84 прикреплено к но— сителю, например пластику, По методу двойной иммунодифйузии в геле

МонАТ D10 — 84 не преципитирует АФП.

При анализе с АФП различных видов млекопитаюгг(их МонАТ D10-84 реагирует только с АФП человека и по результатам иммунойерментного анализа отли— чается более выраженным сродством

30 к АФП от больньгх с первичным раком печени по сравнению с АФП тератоблас— томного или эмбрионального прсисхождения.

Пример, Использование Мо»ЛТ

D10-84 в смеси с МонАТ С2 на твердой фазе для иммунорадиометрического определения АФП.

6 !

».гми Мо»ЛТ используют в качестве твер пой фазы.

Для сравнительной оценки эфйективности связывания смеси МонЛТ 1310-84 и С2-84 аналогичным образом готовят твердую йазу с МонАТ 1)10-84 и С?-84, взятыми отдельно, Конечное разведение асцитических жидкостей D10 и С2 равно:1:1300-1:2000.

Пригодность твердой фазы определяют путем построения кривой стандартов

АФП. Для этого используют стандарты АФП из ко гмерческого набора или амниотическую жщкость с известным содержанием АФП., а также меченные (Ы кроличьи антитела к АФП и буд>ерный раствор из набора или ЗФР-ЛС.

Иммун орали ометрическое опр едел ение АФП проводят в два этапа. Сначала в лунках с иммобилизованными МонАТ инкубируют стандарты АФП (180 мкл) при комнатной температуре (не менее

9 — 12 ч) пли при 37 С (3-4 ч). Затем содержимое лунок удаляют и лунки промывают 3-5 раз под струей водопроводной воды. На втором этапе связавшийся твердой йазой АФП проявляют мечеными антителамп (200 MKJi) в течение 16-20 ч при комнатндй температуо ре или 37 С. Содержимое лунок отсасывают в сборник радиоактивных отходов. Лунки промывают 3-5 раз под струей водопроводной воды, плату высушивают на воздухе и разрезают. Вырезанные лунки помещают в счетные пробирки для счета. Определив скорость счета (имп/мин) в объеме 200 мкл (Т вЂ” общая метка), для каждого стандарта рассчитывают величину связывания метки (В/Тх100%) и строят калибровочную кривую.

При использовании смеси монАТ

D10-84 и С2-84 на твердой йазе определяемая концентрация АФП лежит в диапазоне от 1-5 до 80 нг/мл, тогда как использование тех же МонАТ по отдельности в данном методе обеспечивает неудовлетворительную чувствительность определения.

Ф о р м ул а и з о б р е т е н и я (1тамм культивируемых гибридных клеток животных Миз »sculus 1 .ВСКК

I (II), ¹ 349D, продуцент моноклональ» ных антител против альйа-фетопротеина человека,.