Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l, используемый для получения моноклональных антител к днк- зависимой рнк-полимеразе бактериофага т7

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

Ц П

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВЧ ОРСЙОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4685570/13 (22) 25.04.89 (46) 07.04.91. Бюл. 9 13 (71) Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта (72). И.Л.Дегтярев, Д.А.Костюк и С.H.Êî÷åòêîâ (53) 578. 085. 23 (088. 8) (56) Carroll S.B., Stollar В.D.

Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1982, ч. 79, р. 7233-7237. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ NUS MUSCULUS L ИСПОЛЬЗУЕМый ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ДНК-ЗАВИСИМОЙ РНКПОЛИМЕРАЗЕ БАКТЕРИОФАГА Т7 (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для повьппения качества выделяемого фермента эукариотической PHKполимеразы. Целью изобретения является получение штамма гибридомы, продуцирующего моноклональные антитела

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для повьппения качества выделяемого фермента зукариотической

PHK-полимеразы.

Целью изобретения является полу чение штамма гибридамы, продуцирую- . щего моноклональные антитела (Мон AT) к РНК-полимеразе бактериофага Т7.

Штамм получают следующим образом.

Восьминедельных мышей линии

BALB/Ñ иммунизируют в пятки задних лап но 35 мкг антигена с полным адь-. (51)5 С 12 N 5/00, С 12 P 21/08

2 (N0H AT) и PHK-полимеразе бактриофага Т7. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии BALB/Ñ, иммунизированных очищенным препаратом

PHK-полимеразы бактериофага Т7, с клетками мышиной миеломы линии

Х63,АГ 8.653. Клетки культивируют в среде ДМЕМ с эмбриональной сывороткой коров (107), глютамином (2 ммоль), пируватом натрия (1 ммоль), 2-меркаптоэтанолом (0,05 ммоль}, пенициллином/стрептомицином {1000 ед./мл).

Частота пассирования 2-3 раза в неделю, посевная доза 150 тыс, клетокна 1 мл, кратность посева 5-10 раз °

Продуктивность штамма 10 (по ЕЫБА) в культуральной среде и 3 х 10в в 2 асцитической жидкости. Мон AT, секре- ру тируемые штаммом, специфически взаимодействуют с PHK-полимераэой бакте- С риофага Т7. Штамм депонирован под номером BCKK(II)-351D. Мон AT относят- Д ся к классу IgG1.

1::Р ювантом Фрейнда. Через 4 нед. мышей иий иммуниэируют подкожно в несколько ф мест вдоль спины, шеи, туловища О

50 мкг антигена в неполном адьюванте

Фрейнда. Через 4 нед. вводят 50 мкг антигена внутрибрюшинно без адьюванта. Через 10 дней неимунные мыши линии BaLB/Ñ летально облучают(750 рад) Ъ на рентгеновской установке, через . 24 ч после облучения им внутривенно вводят,лимфоциты, полученные из селезенки иммунной мыши. Одновременно мы шам подкалывают по 30 мкг антигена

1640157.внутрибрюшинно, Четыре дня спустя после трансплантации лимфоцйтов ставят слияние.

Титр антител специфичных к ДНКЭ

5 зависимой 1 НК-полнмеразе бактериофага Т7, составляет в сыворо гке подопытной мьппи 1:2000 при определении с помощью твердофазного иммуноферментного анализа.

Слияние спленоцитов с клетками мьнпиной миеломы линии Х63.АГ8.653 проводят с помощью ПЭГ с мол.масмой .4000. Отношение числа клеток миеломы к числу спленоцитов составляет

1."1. После слияния клетки вносят в лунки 96-луночных панелей. За 1 сут до слияния в лунки 96-луночных панелей высаживают селезеночные клетки (1 млн кл,/мл по ) 00 мкл на 1 лунку), Селекцию гибридомных клонов проводят на среде ГАТ, приготовленной на среде ДМЕМ с добавлением 20%-ной эмбри! ональной телячьей сыворотки и 40 мкг/мл антибиотика гентамицина.

Клетки культивируют в инкубаторе с

6/-ным содержанием СО в атмосфере.

Клоны гибридных клеток появляются через неделю в 60 . лунок.

Через 14-17 дней тестируют культуральные жидкости из лунок с клонами на присутствие специфических антител . методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) .

Клонирование положительных культур гроводят методом предельных разведений, внося 0,5 клетки на 1 лунку

96-луночного плэйта с питающим слоем селезеночных клеток. Клон HNB-4Г7 отобран как лучший продуцент моноклональных антител и повторно клонирован

40 по той же схеме, что и в первый pas, Один из реклонов, характеризующийся максимальной активностью и образованием асцитных опухолей у 100 при- 45 витых мьппей BALB/Ñ, назван ЖБ-477.

Штамм клеток HNS-4F7 депонирован во Всесоюзной коллекции клеточных культур Института цитологии AH CCCP под номером ВСКК(ХХ)Р 351D.

Штамм характеризуется следующими

50 признаками.

Морфологические признаки. Суспен.зионная культура, состоящая из крупных округлых клеток с крупными ядрами и тонким ободком цитоплазмы. ЯдS5 рьппки крупные, по 1-2 в ядре °

Культуральные признаки. Среда для культивирования - среда ДМЕМ: сыворочка эмбриона коровы (10X), сыворотка новорожденных телят (10X), глютамин (2 ммоль), пируват натрия - (1 ммоль), 2-меркаптоэтанол (0,05 ммоль), пеницилин/стрептомицин (1000 ед/мл).

Характер роста - стационарная суспензия. Метод снятия — встряхнвание.

Частота пассирования 2-3 раза в неделю. Посевная доза 150 тыс. клеток на 1 мл. Кратность рассева 5-10 раз.

Контроль контаминаций. Бактерии, грибы и микоплазмы не обнаружены, Культура прививается и растет в виде асцита в перитоне алькой полости мьппей БАЕВ/С. За 7 дней до введения клеток мышам-реципиентам вводят по

0,5 мл пристана. Асцит образуется через 10-15 сут после введения 1-5млн клеток.

Продуктивность штамма. Первичная культура моноклональна. Проведено два клонирования. Все клоны позитивны.

На протяжении 30 пассажей клона HNB-407 интенсивность продукции антител не изменилась (титр антител по ELISA в культуральной среде 10, а в асци ической жидкости 3x10 ).

Мон АТ принадлежат к иммуноглобулинам класса 01.

Консервация клеток. Клетки HNB-4F7 заморожены на 36-и пассаже. Общее количество ампул 20, по 4 млн клеток в ампуле. Криозащитная среда — ростовая среда с 50-60 эмбриональной телячьей сывороткй и 10Х диметилсульфоксида.

Выживаемость при размораживании 95%.

Пример 1,. Культивирование гибридомных клеток ИМБ-4F7.

Во флаконы для культивирования клеток вносят гибридные клетки в концентрации 100-200 тыс. клеток в .1 мл среды ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной с: воротки коровы, 10 сыворотки новорожденных телят, 2 ммоль глютамина, 1 ммоль пирувата натрия, 0,05 ммоль 2-меркаптоэтанола и

1000 ед. пенициллин/стрептомицина.

Клетки инкубируют 2-3 сут в стационарном состоянии при 37 С в атмосфео ре 6% СО . Концентрация клеток, превышающая 1 млн в 1 мл, неблагоприятна для роста клеток и вызывает их гибель. Культуральную жидкость из флаконов с трехдневной культурой тестируют на присутствие Мон AT. При посеве клетки встрях юают, разбавляют ростовой средой до указанной концентрации и разливают по флаконам.

Формула изо бре тения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L

BCKK(II) И- 351Р, используемый для получения моноклональных антител к

ДНК-зависимой РНК-полимераэе бактериофага Т7.

Составитель А.Маныкин

Редактор И.Дербак Техред Л,Олийнык Корректор Л.Патай

Заказ 997 Тираж 378 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.-, д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

5 16401

Пример 2. Культивирование гибридомных клеток ИМБ-4F7.

Клетки, растущие в культуральных флаконах через 1-2 сут после пере сеВ

5 ва центрифугируют 10 мин при 800 об/мин.

Клетки должны быть в концентрации, не превышающей 500 тыс/мл, т.е. находиться в логарифмической фазе роста. Клеточный осадок после центрифугирования ресуспендируют в определенном объеме культуральной среды без сыворотки и подсчитывают число жизнеспособных клеток с помощью трипанового синего. Доводят концентрацию клеток до 1-10 млн/мл и вводят в брюшную полость мышей BALB/Ñ, предварительно обработанных пристаном. Обработку проводят однократно за 1-3 недели до введения гибридомных клеток 20 путем инъекции 0,5 мл пристана. Через 1-3 недели (в зависимости от числа введенных клеток) образуются асцитные опухоли у 100Х. привитых мышей

BALB/С. Количество асцитной .жидкости, накапливающейся в брюшной полости мышей после введения им гибридомных клеток ИМБ-4F7 (в среднем по 20 животным), составляет 5 мл. Содержание

Мон AT в 2 мл асцитной жидкости составляет 10-20 мг.

Пример 3. Использование

Мон AT ИМБ 4F7 в иммуноферментном анализе.

3S

Для определения активности взаимодействия ИМБ 4F7 с антигенными детерминантами ДНК-зависимой PHK-полимеразы бактериофага Т7 применяют метод . непрямого твердофаэного анализа. В качестве твердой фазы используют

57 6

96-луночные пластины, сенсибилиэированные PHK-полимеразой фага Т7 (2,5 мкг/мл белка, по 100 мкл раствора на 1 лунку). Далее в лунки пластин вносят по 100 мкл раствора асцитической жидкости в необходимом разведении в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, содержащем 150 мм NaC1, рН 7,4 (ЗФР). Для снижения неспецифического взаимодействия в ЗФР добавляют до

0,1Х детергента Твин-20 и до 0,2Х бычьего сывороточного альбумина.

Пластины инкубируют 1 ч при 37 С и трижды промывают буфером ЗФР, содержащем 0,05Х детергента Твин-20 (ЗФР-Т) .

После этого в лунки вносят по

100 мкл коньюгата кроличьих антител против иммуноглобулинов мьппи с пе роксидазой хрена и инкубируют 1 ч при 37 Г. После шестикратной промывки ЗФР-Т в лунки вносят хромагенный субстрат и 0,1Х-ную Н О в 0,5 м цитратном буфере (рН 4,0) ° Оптическую плотность субстратной смеси в лунках регистрируют при 405 нм с помощью восьмиканального фотометра и оценивают результаты.

Использование изобретения позволяет выявлять ДНК-зависимую РНК-полимеразу бактериофага Т7.