Способ получения антигена аденовирусов крупного рогатого скота

 

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной вирусологии и касается получения антигенов аденовирусов крупного рогатого скота, необходимых для создания вакцин, диагностикумов и других биологических препаратов , а также для проведения научно-исследовательских работ. Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта. Указанная цель достигается использованием перевиваемых линий клеток почек теленка, выбранных из группы: Таурус-1, Таурус-2 ВСКК (ДП) № 007 и Таурус-4 ВСКК (ДП) № 010, при этом выращивание культуры клеток осуществляют в течение 3-4 дн„, а заражение вирусом осуществляют с множественностью О, 1- 0,2 Т1Щ5о на клетку. &

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4637897/13 (22) 18.01.89 (46) 07.03.91. Бюл. № 9 (71) Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР и Московская ветеринарная академия им. К.И. Скрябина (72) P,В. Белоусова, Л.Л. Миронова, Т.П. Лобова, Н.К. Преображенская и Л.Н. Носач (53) 578.085.23 (088.8) (56) Сюрин В.Н., Фомина Н.В. Частная ветеринарная вирусология. — М.: Колос, 19 79, с. 108 .

Авторское свидетельство СССР № 1347448, кл. С 12 N 5/00, С 12 N 5/02, 1987. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА АДЕНОВИРУСОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной вирусологии и касается получения антигенов аденовирусов крупного рогатого скота, необходимых для создания вакцин, диагностикумов и других биологических препаратов, а также для проведения научно-исследовательских работ.

Цель изобретения — увеличение выхода целевого продукта.

Пример 1. Получение антиге;на аденовируса КРС II подгруппы (7-й с ер отип) пр о водят на линии п ер евиваемых клеток почек теленка Таурус-1, выращенных в стационарных матрасных колбах.

„„Я0 щд2р73 A 1 (S1)S С 12 И 5/00 5/02

2 (57) Изобретение относится к биотехнол огии и в ет ери нар ной вир ус ол огии и касается получения антигенов аденовирусов крупного рогатого скота, необходимых для создания вакцин, диагностикумов и других биологических препаратов, а также для проведения научно-исследовательских работ. Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта. Указанная цель достигается использованием перевиваемых линий клеток почек теленка, выбранных из группы: Таурус-1, Таурус-2 ВСКК (ДП) № 007 и Таурус-4

BCKK (ДП) М - 010, при этом выращивание культуры клеток осуществляют в течение 3-4 дн., а заражение вирусом осуществляют с множественностью О, 1—

0,2 ТЦД о- на клетку.

В 1,5-литровую матрасную колбу с ,клетками линии Таурус-1 на уровне

110 пассажа вводят 0,25Х-ный раствор трипсина, подогретого до 37 С. Через

10-15 с раствор удаляют, а сосуд с клетками помещают в термостат при

37 С на 2-3 мин. Затем вносят небольшое количество питательной среды и энергичным встряхиванием заканчивают процесс отделения клеток от стекла. После этого в клеточную взвесь добавляют среду роста — Игла, МЕМ с 107 сыворотки крупного рогато го скота (CKPC) и разливают на две

1,5-литровые матрасные колбы., Эти культуры III пассажа инкубируют при 37 С в течение 3 сут до момено

16329 73

40 та формирования плотного монослоя.

При заражении вирусом среду иэ культуральных сосудов сливают, клетки однократно промывают питательной сре5 дой и Вводят О 1 ТЦЦ /клетку, Используют штамм вируса Русь 18/81 на уровне 10 пассажа на культуре клеток тестикул бычка после проведения его через организм теленка. Адсорбцию ви- fp руса проводят в термостате при 36 С в течение 90 мин. Затем добавляют

200 мп поддерживающей среды — Игла

hKM беэ СКПС с добавками 0,037 глютамина и 0,04Х аргинина. Культуры ежедневно просматривают под малым . увеличением микроскопа. На вторые сутки примерно 40-502 клеток подвергаются специфической дегенерации, на третьи сутки в процесс вовлекаются 2р практически все клетки. Титр аденовируса равен 7,0 1g ТБД о/мп. В параллельных опытах на первичной культуре клеток тестикул бычка титр вируса равен 4 1g ТЦП р/мп. 25

Пример 2. Получение антигена аденовируса KPC II подгруппы (7-й серотип) проводят на линии перевиваемых клеток почек теленка Таурус-1, выращенных в роллерах. 30

В 1-литровый роллерный флакон с клетками линии Таурус-1 вводят взвесь клеток III пассажа, полученную из 1,5-литрбвой матрасной колбы в объеме 100 мп. Далее культуры готовят по примеру 1. Флакон с клетками помещают в роллерную установку с режимом вращения 20 о6./ч. Заражение культур проводят во примеру 1 с множественностью 0,2 ТЦЦ р /клетку, а сбор вируса осуществляют через 48 ч после заражения. Титр вируса 7,75 1g

ТЦЦ р /мп, В параллельных опытах на первичной культуре клеток тестикул бычка титр 5,5 1g ТЦЦ р/мп °

Пример 3. Получение антигена аденовируса KPC II подгруппы (7-й серотип) проводят по линии перевиваемых клеток почек теленка Таурус-1, выращенных на микроносителях.

В 1-литровую колбу вносят 100< ю10 клеток 115 пассажа, взвешенных в 250 мл среды Игла MEM с 10Х СКРС и

5 мл микроносителя Цитолар-1, содержание примерно 40 тыс. частиц диаметром 230-250 мк.

Адсорбцию клеток на МН проводят в течение 24 ч при 35 С, затем включают магнитную мешалку со скоростью

22 об./мин. На следующие сутки до- бавляют 250 мл свежей питательной среды того же состава. Через 72 ч после формирования монослоя на MH среду роста удаляют, а на клетки вносят 10 мл вирусосодержащей суспензии с титром 4,75 1g ТЦД /мп. Адсорбцию вируса проводят в течение 1 ч при 37 С. После этого вносят до о

500 мл поддерживающей среды, указанного в примере 1 состава. Перед заражением определяют количество клеток в колбе. В данном случае оно было 300 ° 10

Полная дегенерация клеток на МН эар егис трир ова на на тр етьи сутки, когда и производят сбор вируса. Титр вируса равен 7 1g ТЦЦ /мл, Пример 4. Получение антигена аденовируса КРС I подгруппы (1-й серотип) проводят на линии перевиваемых клеток почек теленка

Таурус-2, выращенных в стационарных матрасных колбах.

Культуру на уровне 100 пассажа готовят по примеру 1, но используют на четвертые сутки после экспланта-: ции, когда формируется монослой.

При заражении вводят аденовирус 1-го сер отипа, штамм Bovine-10 с множественностью О, 1 ТЦП р/клетку, адсорбцию проводят в течение 90 мин при 37 С. Все последующие процедур ры осуществляют по примеру 1. Сбор вируса проводят через 96 ч. Титр аденовируса равен 4,5 1g ТЦП р/мл, что не ниже титра вируса, полученного в параллельных опытах на первичной культуре клеток почек эмбриона коровы.

П Р и м е р 5. Получение антигена аденовируса KPC I подгруппы (1-й сер отип) пр оводя т на линии п ер евиваемых клеток почек теленка Таурус-2, выращенных в роллерах. Культуру на уровне 100 пассажа готовят по примеру 2, но монослой формируется и четвертые сутки. При заражении вводят аденовирус f-го серотипа, штамм

Bovine-10 с множественностью

О, 2 ТЦЦ gp/êëåòêó. Все последующие процедуры осуществляют по примеру 1.

Сбор вируса проводят через 96 ч.

Титр аденовируса равен 5,5 1g ТЦД /мл,, В параллельных опытах на первичной культуре клеток почек эмбриона коровы титр вируса составил 5 1g ТЦД .„ /мп „

Формула изобретения

Составитель С. Светлышев

Редактор Н. Яцола Техред Л.Олийнык Корректор N. Максимками нен

Заказ 596 Тираж 384 Подпис ное

ВНИИПИ Государственного, комитета по изобретениям и открытиям при ГЕПТ СССР

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

16329

Пример 6. Получение антигена . аденовнруса КРС II подгруппы (7-й с ер отип) пр оводят на линии п ер евиваемых клеток почек теленка Таурус-4, 5 выращенных в стационарных матрасных колбах. Культуру на уровне 145 пассажа готовят по примеру 1, ее используют на четвертые сутки после формирования монослоя. При заражении вводят аденовирус 7-го серотипа, штамм Русь 18/81 — 0,1 ТЦД ц/клетку.

Все последующие процедуры осуществляют по примеру 1. Сбор вируса проводят через 112 ч. Титр аденовируса равен 5,5 lg ТЦД о/мл. В параллельных опытах на первичной культуре клеток тестикул бычка титр равен 4,5 lg

Тпд зо /мл.

Пример 7. Получение антигека 20 аденовируса КРС II подгруппы (7-й серотип) проводят на линии перевиваемых клеток почек теленка Таурус-4, выращенных в роллерах. Культуру на уровне 145 пассажа готовят по приме- 25 ру 1, ее используют на третьи сутки, когда сформировался монослой. При за-ражении вводят аденовирус 7-ro серотипа, штамм Русь 18/81 — 0,2 ТПД.О/клетку. Все последующие процедуры осу- 3Q ществляют по примеру 1. Сбор вируса проводят через 96 ч. Титр аденовируса

73 6 раве 6 25 lg ТЦД /мн. В парзллельных опытах на первичной культуре клеток тестикул бычка составил 5,5 lg

ТПДВО /MJI.

Т".êèè образом, предлагаемый способ размножения адековирусов КРС разных серотипов ка предлагаемых линиях п ер е вива емых кл ет ок и оч ек т ел е нка, имеющихся в большом количестве в жидком аз от е, является перспективным и высокоэкономичным.

Способ получекия антигена аденовирусов крупного рогатого скота, включающий вырашивание культуры клеток и заражение вирусам с последующей инкубацией, о т л и ч а ю щ и йс я тем> что 9 с це адью УВелич ения выхода целевого продукта, в качестве культуры клеток используют керевиваемые линии клеток почек теленка, выбранные из группы: Таурус-1, Таурус-2

ВСКК (ДП) Р 007 и Таурус-4 HCKK (ДП)

N - 0iO при этом выращивание культуры клеток осуществляют в течение 34 дн., а заражение вирусом осущест— вляют с множественностью О, 1 — 0,2 ТПД на клетку.