Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l., продуцирующий моноклональные антитела к альфа- фетопротеину человека

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и медицине и может быть использовано для иммунолокализации первичного рака печени. Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculusL., продуцирующих моноклональные антитела (МонАТ), способные связываться с альфа-фенопротеином человека (АФП), Итамм получают путем гибридизации клеток селезенки мыши линии BALB/c, иммунизированной очищенным препаратом АФП9 с клетками мышиной миеломы Х-63, Ag 8.653. Гибридома депонирована под номером ВСКК (II) 347D и обозначена F2-84. Клетки гкбридомы культивируют в среде ДМЕМ или RF11I 1640, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки , 2 мМ глютамина, 100 мкг/мл гентамицина при 37 С в присутствии 5% СОл. Пассирование 1 раз в 3-4 дня4 Продуктивность штамма 10-20 мкг/мл. в культуральной жидкости и 5 мг/мл в асцитной жидкости. МонАТ, продуцируемые штаммом, относятся к IgG классу и к § 1 подклассу и проявляют сродство к АФП от больных с первичным раком печени. $

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) А1

Ж (дР

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4684433/13 (22) 31.03.89 (46) 28.02.91. Бюл. 1(=- 8 (71) Всесоюзный онкологический научный центр АМН СССР (72) А.К.Язова, A.È.Гусев, А.В. Андреев и Е.<. Якименко (53) 578.085.23(088.8) (56) I.Immunology Neth., 1988, v.106, р. 19-26.

1 (54) LITAMH ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕ1 ПЖ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ NUS NUSCULUS 1... ПРОДУЦИРУН)ЦИЙ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА

К АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНУ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и медицине и может быть использовано для иммунолокализации первичного рака печени.

Цель изобретения — получение штам1ма гибридных культивируемых клеток животных Hus musculus 1. продуциру1

Изобретение относится к гибридомной технологии и медицине и может быть использовано для иммунолокализации первичного рака печени.

Цель изобретения — получение штамма гибридных культивируемых .клеток животных 1

Ытамм получаю следующим образом.

Мышей линии BALB/ñ иммунизируют очищенным препаратом АФП человека.

Антиген выделяют из смеси сывороток больных с гепатоцеллюлярньм раком (g1)g 0 12 N 5/06, С 12 P 21/08

2 ющих моноклональные антитела (МонАТ), .способные связываться с альфа-фенопротеином человека (АФП). Ытамм получают путем гибридизации клеток селезенки мыши линии BALÂ/ñ, иммунизированной очищенным препаратом АФП, с клетками мышиной миеломы Х-63, Ag 8.653. Гибридома депонирована под номером ВСКК (II) 347Р и обозначена

F2-84. Клетки гибридомы культивируют в среде ДМЕМ или RF .1I 1640, содержащей 157. эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глютамина, 100 мкг/мл гентамицина при 37 С в присутствии

5Е СО . Пассирование 1 раз в 3-4 дня, Продуктивность штамма 10-20 мкг/мл в культуральной жицкости и 5 мг/мл в асцитной жидкости. МонАТ, продуцируемые штаммом, относятся к IgG классу и к / 1 подклассу и проявляют сродство к АФП от больных с первичным раком печени.

1 и тератобластомой методом афинной хроматографии с использованием кроличьих антител к АФП, конъюгированных

I с CNBr-активированной сефарозой 4В.

Полученный препарат смешивают 1::1 с полным адъювантом Фрейнда и каждой мыши вводят 15 мкг АФП в объеме

0 3 мл в шесть точек: подкожно на спине (4 точки по 0,05 мл} и внутримьппеч- Ь но в задние ноги (2х0,05 мл). Через д, месяц .мьппи вводят 75 мкг АФП без адъюванта Фрейнда внутривенно (0„2 мл) и внутрибрюшинно (0,2 мл).. На четвертый день после второго введения антигена берут селезенку, и суспензию

1631077 спленацитов гибридизу}<}т с мьшплнай миеламой Х-63.АВ 8.653. Для этого смесь спленоцитов и миеломы (6,5:1) в виде осадка инкубируют в 3 мл

507. †но палиэтиленгликоля (М.в. 1500) в течение 2 мин. Обработанную смесь клеток высевают в две 96-луночные пластины без фидера из расчета

4х10 спленоцитав в лунку или 4 бх10 смеси клеток в лунку, Клетки культивируют в среде с добавлением 207 лошадиной сыворотки, ? ММ г}<ютамика, 100 мкг/мл гентямицикя. Селекцию гибридных клеток проводят в культуральной среде B присутс}вии гипоксянтина (13,6 мкг/мл), яминаптерина (0,19 мкг/мл) и тимидиня (3,9 MKI"/ìë)„

Появление колоний гибридных клеток зарегистрировано ня 7-й день после слияния. kIa 13 — и день после слияния множественные колонии (3-5 на лунку) вырастают в 100ь засеянных лунок,.

Скрининг проводят иммуноферментным методом с использованием конъюгята кропичьих антител к IВС мьш}и с пероксидазой хрена. В 99i лунок в супернатантах обнаружена специфическая анти-АФП активность, Клонирование и субкланирование позитивных гибри30 дом проводят методом лимитирующих разведений, осуществляя пос.ев гибридом в количестве 3,1 и 0,5 клеток в лунку с заранее приготовленным фидером. В качестве лидера используют клетки перитонеальнага экссудата

<мь}шей BALB/с (5х10 клеток в лунку)., Клонирование пров<}дят на культураль,ной среде, содержащей 15% эмбрианаль— ной телячьей сывар утки. При реклони ровании отмечалос}. 1007, позитивнь}х клонов

Полученный }}}}ямм гибридных клеток депонировак пад }}< }}ерам ВСКК(ХТ)

347D) обозначен Г2-84.

Нтамм хяракгеризуется следующими признаками.

Культуральные свойства.

Гибрицому культивируют в среде (рН 7, 2) ДМЕМ илн RI ? IT — 1640, содер — 50 жащей 15Õ эмбр}}< }}яльнай телячьей сыворотки, 2 ММ г<потямина, 100 мкг/мл гентамицина, при 37"<; в присутствии

57 СО (в пляс<пнях) или без C0g (в плотно закрыт и посуде). Для выра55 щиванйя штамма м<жю использовать .стеклянную или п}}ястиковую пос.уду, Во флаконы емк< с}}.ю 25 см засевают в 7 мл рост<}в<}} средь} 5x10 — 10 кле5 б так штамма Г2-84. Пассирование

<}ранадят один раз в 3-4 дня ой же цозаи клеток (без подсчета клеток их рассеивают из одного флакона на три). Титр антител в культуряльной среде при определении иммунаферментным методом — 2х10

Для культивирования in « ъо мы} шам ВАЬВ/с, сенсибилизированкым пристанам (0,5 мл внутрибрюшинко) за 7 дней до прививки гибридом, вводят внутрибрю}шлнно 5х10 вЂ,0 клеток

6 1 7 штамма F2-84 в 2 мл среды ЕР!П с гентямицином. Асцитическую жидкость забирают у живых мь}}}}ей по мере ее накопления, повторяя забор асцита у одной и тай же мыши не менее 3 раз, Асцитный штамм перевивяют на свежих мышей (5х10 — 10 клеток на мышь), 8 проводя не более рех пассажей, В пулах асцитов, полученных от разных живатнь}х и в разных взятиях, титр антител при определении иммупофер—

-6 ментным методом — 10

Продуктивность штамма. В 1мл культуральной среды содержится не более

10-20 мкг ант:;тел, а в асцитической жидкости — не менее 5 мг/мл антител.

Кокгаминация. Контаминация бактериями и грибами в штамме не обнаружена.

Криаконсервирование. Клетки штам }а ресуспендируют в среде для замораживания, состоящей из эмбриональной телячьей сыворотки, ЖМЕМ или

RPIII-1640 и диметилсул},фоксида (5:4:1). 5х10 клеток ытяммг смешивают с 1 мп такой среды на холоде в пластиковых пробирках, для чего последние держат на льду и сразу же помещают в хранилище с жидким азотом после программнога замораживания материала.

Характеристика целевого продукта.

МонАТ, продуцируемые штаммом F2- 84, относятся к Т8Г классу и к / 1 подклассу мышиных иммуноглобулинов. Константа связывания антител штамма

F2-84 с АФП равна 1,4х10> л/мальв определение проведено жидкофазным конкурентным радиоиммунологическим методом.

Взаимодействие МонАТ с АФП может быть определено иммуноферментным и радиоиммунологическим методами, а также методом смешанной преципитации в геле. МонАТ F2-84 способно связываться с АФП, находяцимся в раство1077

10

163 ре и иммобилизовлнным на твердой AH зе, а также и в том случае, когда само МонАТ F2-84 прикреплено к носителю, например пластику, По методу двойной иммунодиффузии в геле МонАТ

F2 — 84 АФП не преципитирует. При анализе с АФП различных видов млекопитающих МонАТ F2-84 реагирует только с АФП человека и по результатам иммуноферментного анализа обладает практически одинаковым сродством к АФП от больных с первичным раком печени, с тератобластомами и к АФП эмбрионального происхождения. !

Пример 1, Использование

МонАТ F2 — 84 в смеси с МонАТ С2 — 84 на твердой фазе дпя тьердофазного конкурентного радиоиммунологического анализа.

Твердой подложкой слуяа т поверхность полихлорвиниловых пластин, Для иммобилизации МонАТ в лунках инкубируют смесь асцитических жидкостей

F2-84 и С2-84 в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) рН 7,4-7,5 (200 мкл), при комнатной температуре, в течение 9-13 ч, Конечное разведение асцитических жидкостей F2-84 и С2-84 в лунках равно 1:5000. После удаления содержимого лунки промывают двукратно ЗФР, содержащим 1-27. лошадиной сыворотки (ЗФР-ЛС). Тлокировку свободных участков полихролвинила проводят с помощью третьей порции ЗФРЛС, которую оставляют в лунках на

1,5-3 ч при комнатной температуре.

После 2-3-кратной промывки ЗФР- ЛС или водопроводной водой лунки с иммобилизованными МонАТ F2-84 + С2-84 используют в качестве твердой фазы.

В приготовленные лунки последовательно вносят 90 мкл ЗФР-ЛС и 90 мкл смеси (1:l) разведений стандартного препарата АФП с меченным иодом.АФП (8000-10000 имп/мин в лунку). Для определения величины максимального связывания метки (Во) в лунку вносят по 135 мкл ЗФР-ЛС и 45 мкл метки, Содержимое лунок перемешивают. После инкубирования при комнатной температуре в течение 15-17 ч содержимое лунок отсасывается в сборник радиоактивных отходов, лунки промывают

3-5 раз водопроводной водой и высушивают на воздухе. Из пластины вырезают лунки и в них с помощью -счетчика определяют скорость счета (имп/мин).

Онрецелив для каждого разведенния

55 стандартного препарата АФП величину

В1,/Б„ х100Х, строят калибровочную кривую. При использовании смеси МонАТ ! 1

F2-84, + С2-84 в качестве твердой фазы определяемая концентрация АФП находится в диапазоне от 3 до 2000 нг/мл, Пример 2. Использование

МонАТ Р2-84 для сравнительного эпитопного анализа любых других МонАТ к АФП, В сравнительном эпитопном анализе

МонАТ„проводимом любым иммунологическим методом, используется основное свойство МонАТ вЂ” реагировать с уникальной для него детерминантой антигена. Если МонАТ различают разные детерминанты (эпитопы) на антигене, то в большинстве, случаев, если эти эпитопы не представляют стерических помех для одновременного связывания двух антител, при анализе парных смесей МонАТ иммунологические реакции регистрируют различную эпитогную сйецифичность по усилению реакции связывания с антигеном.

Анализ проводят следующим образом.

Лунки 96-луночной пластины инкубируют в течение 1,5 ч при 37 С с раствором

АФП (100 мкл) в конц; нтрации 0,3 мкг/мп на забуференном физиологическом растворе (ЗФР) рН 7,2. Свободные валентности пластика забивают 0,5Х сывороточным альбумином человека на ЗФР с 0,057-ным Твином-20 (200 мюп). Затем лунки в дубликатах инкубируют в течение 1,5 ч при комнатной температуре со. 100 мкл каждого МонАТ по отдельности или смеси двух ИонАТ, приготовленной 1:1. Для этого берут культуральные жидкости в разведении 1:20, а смесь двух ИонАТ готовят так, чтобы каждое МонАТ в смеси также быпо в разведении 1:20. В этом разведении каждое МонАТ находится в избытке по отношению к АФП на пластинке. После отмывания несвязавшихся белков водопроводной водой и ЗФР в лунки вносят по 100 мкл конъюгата кроличьих антител к IgG жш и с пероксидазой хрена., Инкубацию проводят при комчатной температуре в течение 1,5 ч. В отмытые.лунки вносят по 100 мкл раствора

5-аминосалициловой кислоты (0,8 мг/мл,,рН 6,0), и через 45 мин измеряют оптическую плотность раствора в каждой лунке при 450 нм на миниридере. Учитывают среднее значение для двух параллельных лунок и вы7 1631077 в числяют индекс аддитивности (ИА). Be- геном. Следовательно, сравниваемые личина ИА характеризует способность МонАТ связываются с разными эпитопадвух МонАТ одновременно связываться ми АФП, с антигеном, т.е. с различными его зпитопами.

Формула изобретения

Анализ показывает, что МонАТ F2-84, Штамм гибридных культивируемых

D10-84 и С2-84 в парных смесях дают клеток животных tlus rnusculus L. ощутимый прирост в реакции связыва- BCKK(II) Р 347D, продуцирующий мои ия с АФП что свидетельствует об их

У

10 ноклональные антитела к альфа-фето-. одновременном взаимодействии с анти- протеину человека. !

Составитель А. Маныкин

Редактор Л. Пчолинская Техред Л.Сердюкова, Корректор С. Шекмар Уаказ 524 Тираж 369 Подписное

BffHHHH Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðîä, ул. Гагарина, 101