Способ определения ростовых свойств сыворотки крупного рогатого скота

 

Изобретение относится к вирусологии и биотехнологии и касается способа оценки ростовых свойств сыворотки крупного рогатого скота. Цель изобретения - повышение точности способа за счет его стандартизации. Сущность способа состоит в использовании в качестве контрольной культуры клеток стандартизированной линии перевиваемых клеток почек теленка (Таурус-1) 3-4-дневной инкубации. Штамм выращивают в присутствии 10%-ных образцов неинактивированной сыворотки, используя на первый посев 2 ± 1× 10⁶ клеток, и проводят 5 последовательных пассажей с параллельным определением индекса пролиферации культуры.

Изобретение относится к вирусологии и биотехнологии и касается способа оценки ростовых свойств сыворотки КРС всех видов. Цель изобретения - повышение точности способа за счет его стандартизации. В качестве контрольной культуры клеток применяют стандартизированную линию перевиваемых клеток почек теленка (Таурус-1), 3-4-дневной инкубации, используя на первый посев 2±1 х 10⁶ клеток на 1 мл, проводя 5 последовательных пассажей с параллельным определением индекса профилерации культуры. Способ осуществляется стандартным общепринятым методом постановки культуры с применением 10%-ного образца неинактивированной сыворотки и определением на уровне последнего пассажа индекса профирелации. Выбраковке подлежат образцы сыворотки, дающие индекс профилерации не ниже 2, а для работы с первичными культурами - не ниже 1. П р и м е р 1. Оценка ростовых свойств сыворотки крупного рогатого скота (СКРС) (проба 1). В культуральный сосуд с линией клеток Таурус-1 на уровне 95 пассажа вводят 0,25%-ный раствор трипсина, подогретого до 37^оС. Через 1,5 мин раствор удаляют, а сосуды с клетками помещают в термостат при температуре 37^оС на 2-3 мин. После этого в него вносят небольшое количество питательной среды энергичным встряхиванием заканчивают процесс отделения клеток от стекла. Затем готовят взвесь клеток в среде Игла МЕМ из расчета 1 х 10⁶ клеток в 1 мл и вносят по 10 мл в 100 мл флакон, помещая его на узкую поверхность. Испытуемый образец сыворотки добавляют в среду роста в количестве 10%. На анализ одного образца СКРС используют 3 флакона с культурой клеток линии Таурус-1, в качестве контроля только к первому пассажу - аналогичные три флакона с культурой, выращенной с известным образцом качественной сыворотки. Проводят пять последовательных пассажей культур с испытуемым образцом сыворотки по способу, описанному выше, с постоянной кратностью рассева 1:2. В пассажах наблюдают по 3 флакона с культурой. В последнем пассаже производят подсчет количества клеток в гемоцитометре. Индекс профилерации при использовании сыворотки сери 54 составил 2,8. Во всех культурах не зафиксировано признаков токсического воздействия СКРС на клетки, а она признана пригодной для работы с линиями перевиваемых клеток, что и подтвердилось при многочисленных пассажах различных клеток при добавлении в питательную среду этой серии сыворотки. П р и м е р 2. Оценка ростовых свойств сыворотки крупного рогатого скота (проба 2). Культуру клеток с линией Таурус-1 на уровне 70 пассажа готовят по способу, описанному в примере 1. Испытание сыворотки проводят также по этому примеру. К четвертому пассажу зарегистрировано снижение профилеративной активности клеток, в цитоплазме появилась зернистость, нарушалась обычная структура монослоя. Индекс профилерации 1,8. К пятому пассажу монослой сформировался за более длительный срок, и явления деструкции клеточного пласта усилились. Индекс профилерации меньше 1. Сыворотка признана непригодной для работы с культурами клеток. П р и м е р 3. Оценка ростовых свойств сыворотки телят (серия 10). Культуру клеток с линией Таурус-1 на уровне 15 пассажа готовят по способу, описанному в примере 1. При подсчете количества клеток в культуре пятого пассажа индекс профилерации составил 3,1. Сыворотка признана пригодной для работы с линиями перевиваемых клеток. Использование для определения ростовых свойств образцов сывороток КРС линии клеток Таурус-1 по сравнению с ранее используемой линией перевиваемых клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) позволяет стандартизировать технологию оценки пригодности партий сывороток. Использование стандартной линии перевиваемых клеток почек теленка Таурус-1 в качестве тест-культуры обеспечивает объективную оценку ростовых свойств образцов сывороток за счет ее стабильности на протяжении большого количества пассажей (около 25) с сохранением высокой ростовой эффективности. Кроме того, требуется незначительное количество клеток на испытание одного образца с минимальным расходом питательной среды, а время аттестации сывороток не превышает 2,5 недели, и аттестация не отличается трудоемкостью. При испытании серий сывороток КРС на растущей культуре Таурус-1 применяют определенный режим контроля - к четвертому пассажу регистрируют возможные токсические свойства сыворотки, а к пятому проводят конечную аттестацию и выбраковку. В то же время применение линий перевиваемых клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ) ограничено из-за отсутствия отконтролированных линий СПЭВ с заведомо определенными стандартными ростовыми свойствами и возможностью спонтанного контаминирования онкорнавирусами некоторых типов. Скрининг сывороток на первичной эмбриональной культуре затруднен тем, что ее качество зависит от способа ее трипсинизации, наличием спонтанных контаминантов в ткани донора и неучтенным физиологическим состоянием эмбриона.

Формула изобретения

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РОСТОВЫХ СВОЙСТВ СЫВОРОТКИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, включающий пассирование стандартизированной линии перевиваемых клеток животных в среде с образцом неинактивированной и исследуемой сыворотки крупного рогатого скота с последующим инкубированием и определением индекса пролиферации на уровне последнего пассажа, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа за счет его стандартизации, в качестве стандартизированной линии клеток применяют линию перевиваемых клеток почек теленка Таурус-1 после предварительной 3 - 4 дневной инкубации, используя на первый посев 2 ± 1 · 10⁶ клеток на 1 мл среды, и проводят 5 последовательных пассажей.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 19.01.1998

Номер и год публикации бюллетеня: 12-2000

Извещение опубликовано: 27.04.2000        

---