Способ получения целлюлазы

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения целлюлолитических ферментов, дрожжевой и грибной биомассы, и может быть использовано в медицинской и микробиологической отраслях промышленности, а также в сельском хозяйстве. Целью изобретения является расширение функциональных возможностей способа и улучшение качества конечного продукта . Способ осуществляют следующим образом. Синтез целлюлазы проводят на среде, содержащей ферментолизат целлюлоз о со держащего сырья. При этом с целью устранения ингибирования синтеза целлюлазы .глюкозой на ферментолизате предварительно выращивают дрожжи, которые затем удаляют, ферментолизате остаются неусвоенные дрожжами целлодекстрины и метаболиты дрожжей, которые играют роль ростовых факторов для гриба - продуцента целлюлазы. 2 з.п.ф-лы, 5 ил. tf С

СОЮЗ ООВЕТОНИХ

ON

РЕСПУБЛИН (51.)5 С 12 N 9/42

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬП ИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4394911/13 (22) 21.03.88 (46) 07.04,. 91. Бюл. N - 13 (71) Всесоюзный научно-исследовательский и проектно-конструкторский институт микробиологических производств (72) С.Л. Романов и И.И. Бортников (53) 577.15.07(088.8) (56) Лобанок А.Г., Бабицкая В. Г.

Микробиологический синтез белка на целлюлозе. 1976, с. 150-154.

2. Peitersen М. Cellulase and Protein Production from mixed Cultures

of Trichoderma Viride and à Yeast.

Biotechnology and Bioengineering,, 1975, ч. 17, N- 9, р. 1291-1299. (54) спосоБ получения целлюлАЗЫ (57) Изо бре тение о тно сится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения целлюлолитиИзобретение относится к микробио- логической промышленности, а именно к способам получения целлюлолитических ферментов, дрожжевой и грибной биомассы, и может быть использовано в медицинской и микробиологической промышленности, а также в сельском хозяйстве.

Целью изобретения является расширение функциональных возможностей

: способа и улучшение качества конечного продукта.

На фиг. 1 .изображена схема, поясняющая способ; на фиг. 2-4 — графики активности целлюлазы; на фиг. 5— типичные хроматограммы..„Я0„„1640161 А 1 ческих ферментов, дрожжевой и грибной биомассы, и может быть использовано в медицинской и микробиологической отраслях промышленности, а также в сельском хозяйстве. Целью изобретения является расширение функциональных возможностей способа и улучшение качества конечного продукта. Способ осуществляют следующим образом. Синтез целлюлазы проводят на среде, содержащей ферментолизат целлюлозосодержащего сырья. При этом с целью устранения ингибирования синтеза целлюлазы .глюкозой на ферментолизате предварительно выращивают дрожжи, которые затем удаляют. ферментолиз ате остаются неусвс енные дрожжами целлодекстрины и метаболи-, ты дрожжей, которые играют роль ростовых факторов для гриба — продуцента целлюлазы. 2 з. и, ф-лы, 5 ил.

Способ осуществляют следующим об-, ар разом. 4:

Синтез целлюлазы проводят на сре- в де, содержащей ферментолизат целлюлоэосодержащего сырья. При этом с целью устранения ингибирования синтеза целлюлазы глюкозой (т.е. эффект катаболитной репрессии) на ферментолизате предварительно выращивают дрожжи, которые затем удаляют. В ферментолизате остаются неусвоенные дрожжами

;целлодекстрины и метаболиты дрожжей, .которые играют роль ростовых факторов для гриба — продуцента целлюлазы.

Продуцент выращивают на целлодекстринах, при этом образуется свободная.1 640161 от остатков субстрата пищевая грибная биомасса, а в культуральной жидкости - целлюлаза. Часть целхполазы .используют как товарный продукт, а часть (5-20%) - на приготовление ферментолизата. Ферментолизат у целью инактивирования целлюлозы и прекращения дальнейшей деградации целлодекстринов до глюкозы прогревают при 70 С.

В качестве целлюлозосодержащих отходов используют макулатуру, волокнистый материал отстойников бумажных фабрик, хлопковый линь, отходы текстильной промышленности - пух фильтровой, подметь серая, подметь масляная, вискозная рвань. Такие отходы являются нелигнифицированной целлюлозой и не нуждаются в предварительной делигнификации.

В качестве грибов - продуцентов целлюлазы используют следующие штаммы.

Trichoderma 11gnorum ОИ534А 25

Trichoderma viride чИ9414

Trichoderma 1ignorum 60

Trichoderma lignorum ЯИ6А

Trichoderma Roningii sp.

Trichodenna lignorum 19

ЗО

Trichoderma viride HP»14

В качестве микроорганизмов, усванвающих глюкозу из ферментолизата целлюлозосодержащих отходов, исполь" зуют любые виды дрожжей, способные к росту на глюкозе. Однако, учитывая, что оптимум рН получения.ферментолизата с помощью целлняазы грибов рода Trichoderma составляет 4,8-5,0, наиболее целесообразно применение дрожжей вида К1uvегоmyces {Saccha romyces) fragilis которые имеют тот же оптимум рН для роста биомассы.

Это позволяет не корректировать рН при выращивании дрожжей на ферменто- 45 лизате; избежать бактериального заражения дрожжевой биомассы в процессе нестерильного культивирования.

Схема йоясйяющая способ (фиг. 1), включает блок 1 корректировки рН и питательных компонентов среды 2, аппарат 3 ферментативного гидролиза целлюлозосодержащего сырья с транспортирующим устройством 4 и транспорTapyíèöèì устройством 5 для отвода непрогидролизованного остатка,,аппарат

6 для культивирования дрожжей с транспортирующим устройством 7 для отвода товарных пищевых дрожжей, аппарат 8 для культивирования грибов с транспортирующим устройством 9 для отНода грибной биомассы и аппарат-распределитель 10 для целлюлазы с транспортирующим устрой ством 1 1 TpaacnopTa» рующие устройства 12-17 для подачи в аппараты 3, 6 и 8 нужных питательных сред и=компонентов, а также по" дачи обрабатываемых сред соответственно в аппараты 6 и 8 и аппаратраспределитель 10.

Способ получения целлюлазы и микробной биомассы осуществляют следующим образом.

Целлюлозосодержащие отходы по транспортирующему устройству 4 поступают в аппарат 3. В этот же аппарат по транспортирующему устройству 12 подается из аппарата-распределителя f0 в нужном количестве культуральная жидкость, содержащая целлюлазу, а по транспортирующему устройству 14 подают воду, питательные компоненты, в случае необходимости кислоту, напри- мер фосфорную Н РО, щелочь, например гидроокись аммония NH ОН. Эти компоненты перемешивают в аппарате 3 до образования в нем раствора, содержащего питательные компоненты следующего состава, %: азотнокислый аммоний NB>NO> 0,7-1,0; фосфорнокисхп и одно замещенный калий КНзРО

0,3-0,5; сульфат магния АБО„ 7Н О

0,05. При этом рН раствора доводят до 4,5-5,0.

В аппарате 3 происходит осахаривание целлюлозосодержащего сырья, так как целлюлаза, содержащая полноценный комплекс гидролитических ферментов, гидролизует целлюлозу с образованием глюкозы, целлобиозы и целло.декстринов. различной степени нолимеризации. При достижении концентрации глюкозы в пределах 1-3% раствор яв4 ляющийся ферментативным гндролизатом, содержащим компоненты минерального питания, прогревают в течение 10 мин до 70 С и направляют as аппарата 3 в аппарат б по транспортирующему устройству 15 на дальнейшую обработку.

Непрогидролизованный остаток из аппарата 3 выводят по транспортирующему устройству 5.

В аппарат 6 по транспортирующему устройству 18 подают посевной материал для выращивания биомассы, на пример дрожжи Kluvегоmyces fkagilis в количестве 5% от объема среды.

1640161

Дрожжи культивируют до полного по.глощения из среды глюкозы (максимального синтеза биомассы дрожжей). В периодическом процессе культивирова5 ние дрожжей Kluvегоmyces jragilis проводят в течение 20-24 ч при 24-26 С и аэрации в количестве 100-125 объемов на 1 объем культуральной среды в 1 ч. Дрожжи усваивают из фермен- 10 тативного гидролизата глюкозу и часть элементов минерального питания, при этом в аппарате 6 накапливается биомасса дрожжей Kluvегоmyces f ragi lis и растворимые внеклеточные метаболиты дрожжей. По окончании процесса ферментации в аппарате 6 биомассы дрожжей отделяют: фильтруют, сепарируют, уплотняют и так далее (не показано), выводят из аппарата 6 по транспортирующему устройству 7 и испОльзуют в качестве пищевой белковой биомассы. Культуральная жидкость из этого аппарата транспортирующим устройством 16 подается в аппарат 8 для дальнейшей обработки.

Кроме того, в аппарат 8 из блока

1 транспортирующим устройством 13 подают фосфорную кислоту (или ее водный раствор) с целью коррекции рН до 4,8-5,0, а по транспортирующему устройству 19 подают посевной материал культивируемых микрогрибов, например,,рода Trichoderma в количестве 5-8Х от объема среды.

В аппарате 8 при, культивировании грибов рода Trichoderma под действием находящихся в среде индукторов — целлобиозы и целлодекстринов образуется целлюлаза и одновременно

40 накапливается грибная биомасса. При этом растворимые внеклеточные метаболиты дрожжей Kluvегоmyces Гragilis служат ростактивирующими факторами для микро грибов . Гриб рода Tr i choderma культивируют до максимального синтеза целлюлазы. В периодическом процессе культивирование гриба проводят в течение 24-48 ч при 30-55 С и аэрации в количестве 45-60 объемов воздуха на объем культуральной среды в 1 ч. По окончании процесса ферментации биомассу гриба отделяют от культуральной среды и по транспортирующему устройству 9 выводят из аппарата 8 для дальнейшей обработки и использования в качестве белкового товарного продукта (уплотнение, фильтрация, сушка, упаковка).

Из аппарата 8 в аппарат-распределитель 10 по транспортирующему устройству 17 поступает культуральный фильтрат, который в аппарате-распределителе 10 разделяют на два потока.

Один поток транспортирующим устройством 11 выводится из аппарата-распределителя 10 иа дальнейшую технологическую обработку: сгущение, сушка, очистка и другое (не показаны) с целью получения товарной целлюлазы, а второй поток направляется транспортирующим устройством 12 для осуществления процесса гидролиэа целлюлозосодержащих отходов в аппарат 3.

Способ получения целлолазы и товарной микробной биомассы предусматривает при необходимости стерилизацию питательной среды, поступающей в аппарат 8. Технологическая схема может быть реализована как в периоди-. ческом, так и в непрерывном процессе.

В последнем случае посевной материал вносят лишь на стадии пуска.

Пример 1. Посевной материал гриба — продуцента целлюлаэы Trichoderma 1ignorum 0N534 (коллекция Института микробиологии АН БССР) выращивают в пробирках на косом агаре, поверх которого помещают стерильные полоски фильтровальной бумаги. Для приготовления косяков используют среду состава, г: NANO> 5,0; КН РО4, 4,0;

MgS04 7Н20 0,5; агар 203 водопроводная вода 100 мл. Жидкую питательную среду засевают смывом 14-суточной культуры из расчета 50 мл стерильной воды на 1 пробирку с посевной культурой и 1 0 мл суспензии используют для засева 100 мл среды.

В колбу со 100 мл среды помещают

2 г фильтровальной бумаги и культивируют в течение 4 сут до достижения активности целлюлазы 1,5-2,0 ед. На фиг. 2 показаны изменения при культивировании активности целлюлаз по фильтровальной бумаге (кривая 1), активности целлюлаз по растворимой целлюлозе (кривая 2) и рН культуральной среды (кривая 3}.

Грибную биомассу отфильтровывают через нейлоновую ткань, а культуральную жидкость подкисляют фосфорной кислотой до рН 4,8-5,0 и центрифугируют с целью удаления взвешенных частиц. Затем к S г целлюлозы добавляют 100 мл раствора целлюлазы (культуральной жидкости) и выдержи10

J

7 164 вают в течение 1-2 ч при 40 С. При этом происходит распад целлюлозы до . целлодекстринов, целлобиозы и глю..-козы. Непрогидролизованный остаток отфильтровывают, а ферментолизат, с целью инактивации целлюлаз ° нагрео

Р вают до 70 С и выдерживают 10 мин.

На фиг. 3 показана термостабильность целлюлазы (прогрев в течение 5 мин).

В результате предотвращения дальнейший гидролиз целлодекстринов до более низкомолекулярных соединений и глюкозы, С целью контроля углеводного состава аликвоту Ферментолизата упаривают на роторном испарителе или в вакуум-сушильном шкафу в 5-10 раз, отфильтровывают и Фильтрат наносят на бумажную хроматограмму, которую элюируют в восходящем потоке в системах изопропанал:вода=1:1,6 и этю ацетатапиридин:вода-4,1:0,5, Хромато граммы проявляют 1Ж-ным раствором солянокислого п-анидизина в этаноле или щелочным раствором AgNQ -

Ha фиг. 5 показаны типичнйюе хроматограммы: а — макулатура, гидролизованная культуральным фильтратом

T. 1х@погцш ОМ534; б - гидролизат после выращивания на нем дрожжей

K. Йragilis  — культуральный Фильтрат К. fragilis после выращивания на нем гриба T. lignorum ON534; гсвидетели (А — целлабиоза, В «глюкдза,  — арабиноза, Р - ксилоза, Х вЂ” целлоде кстрины) . Целлюлаза Т. lignoxum ОИ534 образует смесь глюкозы, целлодекстринов, арабинозы, ксилозы, неидентифицированный сахар и следы целлобиозы, поскольку обладает значительной целлобиазной активностью (фиг,.5 a).

Для удаления глюкозы из Ферментолизата на нем выращивают дрожжи

K. (Sacch.) Кragilis (коллекция Института микробиологии AH БССР).

Дрояоки К. Кragilis выращивают в пробирках на скошенном сусло-агаре.

В качестве посевного материала используют смыв 3-суточной культуры дрожжей. из расчета 10 мл стерильной; воды на 1 пробирку с посевной культурой и 10 мл суспензии используют для засева 100 мл ферментолизата.

Дрожжи выращивают на круговой качалке 200 об/мин при 28 С в тече6 ние 1,5-2 оут, после чего суспензию центрифугируют, а в культуральной жидкости контролируют содержание редуцирующих веществ и хроматографически состав углеводов (фиг, 5б)., Выращивание на ферментолизате дрожжей К. (Sacch.) fragilis снижает содержание глюкозы, арабинозы и ксилозы до следовых количеств. Неутилизируемой остается фракция целлодекстринов (фиг. 5б) . Однако выращивание на ферментолизате культуры T. lignorum приводит к усвоению целлодекстринов (фиг. 5в), а также снижению количества редуцирующих веществ в среде, Культуральную жидкость с целлодекстринами стерилизуют при 1,5 атм в течение 30 мин. После охлаждения разливают в колбы Эрленмейера по

100 мл и засевают каждую 10 мл суспензии спор гриба Trichoderma lignorum ОМ534, Гриб культивируют в течение 3 сут до получения максимальной активности целлюлазы 1,5-2,0 ед. Динамика синтеза целлюлазы Т. lignorum

ОИ534 на среде с целлодекстринами показана на Фиг. 4. Биомассу гриба, не содержащую нерастворимого субстрата, отфильтровывают, а часть культуральной жидкости (целлюлазы) используют для получения новой порции ферментолизата. При этом цикл повторяется.

Формула изо бре те ния

Способ получения целлюлазы, включающий приготовление питательной среды для гриба - продуцента целлюлазы, глубинное культивирование на питательной среде, содержащей источ- ник целлюлозы, подвергнутый гидролизу, гриба — продуцента целлюлазы рода Txi—

choderma н дро юкей Saccharomyces, о тличающийсятем, что, с целью расширения функциональных воз1 можностей способа и улучшения качества конечного продукта, при приготовлении питательной среды для гриба— нродуцента целлюлазы источник целлюлозы подвергают ферментативному гидролизу с помощью целлюлазы, в полученном ферментолизате инактивируют целлюлазы.прогреванием и осуществляют последовательное глубинное культивирование дрожжей и гриба - продуцента целлюлаз, причем дрожжи культивируют до полного истощения в культуральной среде моносахаридов, удаляют их и культивируют на полученной

1 640161

1О среде гриб - продуцент целлюлаз с последующим разделением культуральной жидкости на биомассу и целлюлазу, часть которой возвращают на стадию приготовления питательной среды для ферментатнвного гидролиза источника . целлюлозы.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что культивирование дрожжей проводят в течение 20 24 ч при 24-26оС.

3 ° Способ HO BH 1 H 2, о T Jl H ч а ю шийся тем, что культивирование гриба - продуцента целлюлаз проводят в течение 24-48 ч при 3055 С.

2 3 ф 5 6 7

Продотип еиьносяь щаво0иробания, сусл.

Фиг.Z

1б40161

Ф 5 б 7

Составитель А.Семенов

Редактор И.Дербак Техред Л,0лийньщ . Корректор Л.Патай

Заказ 997 Тираж 367 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ"МСВ

113035 Иосквар Ж-35р Раушская набэ да 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101 о, с-о ю

ТЕ. тИЗС(гпу00 сь l a ф о